Strategie rozwiązywania problemów w oczyszczaniu białek znakowanych GST

Niniejszy przewodnik rozwiązywania problemów odnosi się do typowych problemów związanych z większością metod oczyszczania z wykorzystaniem różnych podłoży z sefarozy glutationowej.

Problem	Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Białko znakowane GST nie wiąże się lub słabo wiąże się z podłożem.	Prędkość przepływu stosowana podczas ładowania próbki jest zbyt wysoka.	Zmniejsz prędkość przepływu podczas ładowania próbki lub, gdy stosowane są metody ręczne, inkubuj próbkę po załadowaniu. Jednym z najważniejszych parametrów wpływających na wiązanie białek znakowanych GST z sefarozą glutationową jest szybkość przepływu. Ze względu na stosunkowo powolną kinetykę wiązania między GST i glutationem, ważne jest, aby utrzymać niskie natężenie przepływu podczas ładowania próbki w celu uzyskania maksymalnej zdolności wiązania.
	Białko znakowane GST denaturowane przez mechaniczną lizę (np. sonikację). Zbyt rozległa liza może zdenaturować znakowane białko i uniemożliwić jego wiązanie.	Używaj łagodnych mechanicznych/chemicznych warunków lizy podczas lizy komórek. Warunki lizy muszą być określone empirycznie.
	Białka znakowane GST agregują w próbce, powodując wytrącanie.	Dodaj DTT do próbki przed lizą komórek, a także dodaj DTT do buforów. Dodanie DTT do końcowego stężenia od 1 do 20 mM może znacznie zwiększyć wydajność niektórych białek znakowanych GST.
	Stężenie znakowanego białka jest zbyt niskie.	Skoncentruj próbkę za pomocą urządzeń do zatężania Vivaspin™. Kinetyka wiązania zależy od stężenia. Białka o niskiej ekspresji mogą nie wiązać się tak skutecznie jak białka o wysokiej ekspresji; dlatego zatężenie próbki może poprawić wiązanie.
	Znakowane białko mogło zmienić konformację GST, zmniejszając w ten sposób powinowactwo do białka znakowanego GST.	Sprawdź wiązanie GST z rodzicielskiego plazmidu pGEX: Przygotuj lizat komórek zawierających rodzicielski plazmid pGEX i sprawdź wiązanie z podłożem. Jeśli GST wytworzone z plazmidu rodzicielskiego wiąże się z wysokim powinowactwem, znakowane białko mogło zmienić konformację GST, zmniejszając w ten sposób powinowactwo do białka znakowanego GST. Odpowiednie wyniki można uzyskać zmniejszając temperaturę używaną do wiązania do 4 °C i ograniczając płukanie.
	Czas wyrównania jest zbyt krótki.	Upewnij się, że kolumna została wyrównana za pomocą co najmniej 5 objętości buforu o pH od 6,5 do 8,0 (np, PBS).
	Wiązanie białek znakowanych GST nie jest skuteczne przy pH niższym niż 6,5 lub wyższym niż 8.	Kolumnę należy wyrównać buforem o pH od 6,5 do 8,0 (np, PBS) przed zastosowaniem oczyszczonego lizatu komórkowego. Upewnij się, że liza jest przeprowadzana przy pH 6,5 do 8,0. Sprawdź, czy próbka została dostosowana do warunków buforu wiążącego.
	Kolumna GSTrap: Kolumna wymaga czyszczenia.	Wyczyść kolumnę zgodnie ze standardowym protokołem czyszczenia. Jeśli kolumna GSTrap była już używana kilka razy, może być konieczna jej wymiana na nową.
	Podłoże z sefarozy glutationowej było używane zbyt wiele razy.	Użyj świeżego podłoża Glutathione Sepharose.
	Kolumny GSTrap. Kolumna lub system ÄKTA są zatkane, co prowadzi do wysokiego przeciwciśnienia i braku wiązania.	Zatkana kolumna: Wyczyść kolumnę zgodnie z instrukcjami. Przed załadowaniem upewnij się, że próbka została odwirowana i/lub przefiltrowana przez filtr 0,45 µM. Zatkany system: wyczyść system zgodnie z instrukcją.
Białko znakowane GST nie jest skutecznie eluowane.	Objętość buforu elucyjnego jest niewystarczająca.	Zwiększ objętość buforu elucyjnego. W niektórych przypadkach, zwłaszcza po rozszczepieniu znakowanego białka na kolumnie, większa objętość buforu może być konieczna do elucji znakowanego białka.
	Czas elucji jest niewystarczający.	Zwiększ czas trwania elucji poprzez zmniejszenie szybkości przepływu podczas elucji. W przypadku kolumn GSTrap należy użyć natężenia przepływu od 0,2 do 1 ml/min (kolumna HiTrap 1 ml) i od 0,5 do 5 ml/min (kolumna HiTrap 5 ml) podczas nanoszenia próbki. W przypadku metod wirowania należy zmniejszyć prędkość wirowania podczas elucji.
	Stężenie glutationu jest niewystarczające.	Zwiększ stężenie glutationu w buforze elucyjnym: Zalecane 10 mM powinno być wystarczające dla większości zastosowań, ale czasami stężenie to musi zostać zwiększone. Wypróbuj 50 mM Tris-HCl, 20 do 40 mM zredukowanego glutationu, pH 8.0 jako bufor elucyjny.
	PH buforu elucyjnego jest zbyt niskie.	Zwiększ pH buforu elucyjnego: Zwiększenie pH do 8-9 może poprawić elucję bez konieczności zwiększania stężenia glutationu używanego do elucji.
	Siła jonowa buforu elucyjnego jest zbyt niska.	Zwiększ siłę jonową buforu elucyjnego: Dodanie 0,1 do 0,2 M NaCl do buforu elucyjnego może również poprawić wyniki.
	Glutation w buforze elucyjnym jest utleniony.	Użyj świeżego buforu elucyjnego lub dodaj DTT.
	Niespecyficzne interakcje hydrofobowe z podłożem powodują agregację białek, uniemożliwiając solubilizację i elucję znakowanych białek.	Dodaj niejonowy detergent do buforu elucyjnego: Dodanie 0,1% Triton X-100 lub 2% n-oktyloglukozydu może znacznie poprawić elucję niektórych typów białek znakowanych GST.
Po elektroforezie / analizie Western blot eluowanego białka docelowego obserwuje się wiele pasm.	Białko Mr 70 000 kopuruje z białkiem znakowanym GST.	Białko Mr 70 000 jest prawdopodobnie produktem białkowym genu dnaK E. coli. Białko to bierze udział w fałdowaniu białek w E. coli. Doniesiono, że takie powiązanie może być zakłócone przez inkubację znakowanego białka w 50 mM Tris-HCl, 2 mM ATP, 10 mM MgSO4, pH 7,4 przez 10 minut w 37 °C przed załadowaniem. Alternatywnie, białko DnaK może być usunięte przez przepuszczenie roztworu znakowanego białka przez ATP-agarozę lub podobne podłoże oczyszczające, lub przez przeprowadzenie wymiany jonowej.
	Znakowane białka mogły zostać częściowo zdegradowane przez proteazy.	Dodaj inhibitor proteazy: Wiele pasm może być wynikiem częściowej degradacji znakowanych białek przez proteazy. Dodanie 1 mM PMSF do roztworu do lizy może poprawić wyniki. Nietoksyczną, rozpuszczalną w wodzie alternatywą dla PMSF jest chlorowodorek 4-(2-aminoetylo)-benzenosulfonylu (AEBSF), dostępny w handlu jako Pefabloc™ SC od Roche Biochemicals. Uwaga: Inhibitory proteaz serynowych muszą zostać usunięte przed rozszczepieniem przez trombinę lub czynnik Xa. Proteaza PreScission nie jest zgodną proteazą serynową i jest niewrażliwa na wiele inhibitorów proteazy testowanych w Cytiva. PMSF jest toksyczny, z ostrymi skutkami. W miarę możliwości należy stosować Pefabloc.
	Proteoliza mogła wystąpić w bakteriach gospodarza.	Użyj gospodarza z niedoborem proteazy: Wiele pasm może być wynikiem proteolizy w bakteriach gospodarza. W takim przypadku może być wymagane użycie szczepu E. coli z niedoborem gospodarza (np, lon- lub ompT). E. coli BL21 jest wadliwy w produkcji proteaz OmpT i Lon.
	Rozerwanie komórek mogło być zbyt rozległe podczas  mechanicznej lizy.	Zmniejsz czas lizy: Rozerwanie komórek jest widoczne przez częściowe oczyszczenie zawiesiny i może być sprawdzone przez badanie mikroskopowe. Dodanie lizozymu (0,1 objętości 10 mg/ml roztworu lizozymu w 25 mM Tris-HCl, pH 8,0) przed lizą mechaniczną może poprawić wyniki. Unikaj spieniania, ponieważ może to spowodować denaturację znakowanego białka. Nadmierna liza może również prowadzić do kopuryfikacji niektórych białek gospodarza z białkiem znakowanym GST.
	Chaperony mogły ulec kopuryfikacji.	Włącz dodatkowy etap oczyszczania: Dodatkowe pasma mogą być spowodowane kopuryfikacją różnych białek znanych jako chaperony, które biorą udział w prawidłowym fałdowaniu powstających białek w E. coli. Należą do nich między innymi: DnaK (Mr ~ 70 000), DnaJ (Mr ~ 37 000), GrpE (Mr ~ 40 000), GroEL (Mr ~ 57 000) i GroES (Mr ~ 10 000). Opisano kilka metod oczyszczania białek znakowanych GST z tych białek kopurujących.
	Przeciwciała, które reagują z różnymi E. coli białka mogą być obecne w próbce znakowanego białka.	Przeciwciało adsorbowane krzyżowo z E. coli białkami: W zależności od źródła przeciwciała anty-GST, może ono zawierać przeciwciała reagujące z różnymi białkami E. coli, które mogą być obecne w znakowanej próbce białka. Przeciwciało należy poddać adsorpcji krzyżowej z lizatem E. coli w celu usunięcia przeciwciał antyE. coli z preparatu. Przeciwciało anty-GST firmy Cytiva zostało poddane adsorpcji krzyżowej z białkami E. coli i przetestowane pod kątem braku niespecyficznego wiązania tła w Western blot.