Synteza lub ekspresja białek bez udziału komórek

Czytaj więcej

• Czym jest synteza białek bez udziału komórek?
• Jak działa in vitro translacja?
• Jakie typy komórek są używane do generowania ekstraktu?
• Jak wypada synteza białek bez komórek w porównaniu do innych metod produkcji białek?
• Zastosowania bezkomórkowej syntezy białek?
• Zestaw do bezkomórkowej ekspresji białek nowej generacji (zarodki pszenicy)
• Publikowane badania wykorzystujące nasz system bezkomórkowej ekspresji białek
• ALiCE^® Cell Free Protein Expression Kit (Plant Cell Lysate)
• Powiązane produkty

Co to jest bezkomórkowa synteza białek?

Bezkomórkowa synteza białek, będąca formą biologii syntetycznej, jest szybką metodą produkcji rekombinowanych białek w roztworze bez udziału komórek. Wykorzystując biomolekularną maszynerię translacyjną wyekstrahowaną z szeregu różnych typów komórek, CFPS umożliwia naukowcom ekspresję interesującego białka w ciągu jednego dnia. Idealne podejście do translacji funkcjonalnych białek in vitro , nadające się do różnych dalszych zastosowań, CFPS jest zaufaną techniką stosowaną w różnych obszarach badawczych.

Jak działa tłumaczenie in vitro?

CFPS wymaga szablonu DNA (plazmidu lub produktu PCR) kodującego docelowe białko oraz roztworu zawierającego wszystkie niezbędne składniki do napędzania transkrypcji i translacji. Roztwór ten jest ekstraktem bezkomórkowym, tak zwanym, ponieważ składa się tylko z materiału cytozolowego i organelli, podczas gdy błony komórkowe zostały usunięte. Po połączeniu materiału genetycznego i ekstraktu bezkomórkowego można rozpocząć ekspresję docelowego białka.

Jakie typy komórek są używane do generowania ekstraktu?

Wczesne eksperymenty CFPS wykorzystywały ekstrakt bezkomórkowy pochodzący z E. coli. Dzięki szybkiej kinetyce wzrostu, E. coli szybko zapewnia wysoką wydajność białka, jednak niektóre białka eukariotyczne okazały się nierozpuszczalne po E. coli CFPS. Postęp w tej dziedzinie doprowadził do wykorzystania różnych typów komórek, w tym kiełków pszenicy, Leishmania tarentolae, retikulocytów królika, komórek owadzich, roślinnych i ludzkich.

Każdy typ komórek oferuje różne zalety. Na przykład, przy użyciu ekstraktu z kiełków pszenicy możliwa jest translacja dużych białek. Co więcej, ekstrakt z kiełków pszenicy nie zawiera endogennych mRNA, które mogłyby być tłumaczone wraz z białkiem docelowym. Białka ekspresjonowane z kiełków pszenicy zachowują również swoją złożoną trójwymiarową konformację, ponieważ pochodzą ze źródła eukariotycznego. W przypadku stosowania ekstraktu z komórek roślinnych wydajność można zwiększyć do 3 mg / ml, a składanie złożonych białek i ich glikozylacja są możliwe.

Jak wypada bezkomórkowa synteza białek w porównaniu do innych metod produkcji białek?

Ekspresja rekombinowanych białek w żywych komórkach jest dobrze znaną i szeroko stosowaną metodą produkcji białek. W tym podejściu DNA kodujące docelowe białko jest klonowane do wektora ekspresyjnego, który jest następnie wprowadzany do linii komórek gospodarza poprzeztransfekcja komórek, transformację bakteryjną lub wykorzystując wirusy poprzeztransdukcję wirusową. Wadą tej metody jest to, że niektóre nadeksprymowane białka mogą wykazywać aktywność szkodliwą dla gospodarza. Dodatkowo, produkty CFPE są droższe niż białka produkowane w żywych komórkach. Dzieje się tak zwłaszcza w przypadku, gdy wymagane są duże ilości materiału lub gdy białko nie ulega szczególnie dobrej ekspresji. Z tego powodu CFPE jest zwykle wykorzystywany do generowania białek do eksperymentów na małą skalę przy wysokich kosztach.

Jednakże, eliminując potrzebę klonowania lub hodowli komórkowej, CFPS zapewnia znaczną oszczędność czasu w porównaniu z ekspresją białek rekombinowanych. Dodatkowo, CFPS jest bardziej przystosowany do zastosowań o wysokiej wydajności i może zapewnić zwiększoną ogólną wydajność. Brak błony komórkowej pozwala również na łatwiejsze manipulowanie warunkami reakcji, w tym włączanie znakowanych aminokwasów.

Zastosowania bezkomórkowej syntezy białek

CFPS ma zastosowanie w szerokim zakresie badań, w tym:

• Charakteryzacja interakcji białko-białko lub białko-nukleina
• Analizy strukturalne lub funkcjonalne białek pełnej długości, skróconych lub zmutowanych
• Identyfikacja składników niezbędnych do fałdowania, stabilności lub degradacji białek
• Produkcja mikromacierzy białkowych
• Ekspresja cząstek wirusopodobnych
• Identyfikacja kandydatów na leki
• Wyświetlanie rybosomów

Użyteczność CFPS prawdopodobnie wzrośnie, ze względu na potencjał, jaki oferuje w zakresie wysokowydajnej, opłacalnej produkcji dużych ilości białek o jakości badawczej.

Zestaw do ekspresji białek bezkomórkowych następnej generacji (z kiełków pszenicy)

Opracowany w celu pokonania bariery kosztowej CFPE, przy jednoczesnym zapewnieniu doskonałej stabilności, wyższej wydajności i większej elastyczności dla większej różnorodności białek docelowych niż wiele dostępnych na rynku produktów, nasz zestaw do ekspresji białek bezkomórkowych nowej generacji (kiełki pszenicy) jest opłacalnym rozwiązaniem, a jednocześnie zapewnia wysoką wydajność CFPE. Przy średniej wydajności 10 µg/reakcję (50 reakcji w każdym zestawie), nasz zestaw oferuje wiele zalet, w tym możliwość zastosowania do wysokowydajnej produkcji białek i przyjazny dla użytkownika protokół.

Szczególnie odpowiedni do produkcji białek o skomplikowanej konformacji i wielu kompleksów białkowych, takich jak białka zawierające wiązania dwusiarczkowe lub integralne białka błonowe, nasz zestaw był z powodzeniem stosowany przez naukowców do produkcji szerokiej gamy białek.

Rysunek 1 Łatwo skalowalna produkcja białek przy użyciu zestawu MilliporeSigma Next Generation Cell Free Protein Expression Kit (Wheat Germ) (CFPS700).

Połączenie maszyn, miceli i organelli w naszym ekstrakcie z kiełków pszenicy oznacza, że nawet białko błonowe może być rozpuszczalne bez potrzeby dodawania liposomu. Ponadto, wiązania dwusiarczkowe są indukowane przy użyciu naszego zestawu z opcjami znaczników N- lub C-końcowych. Dalsze zalety obejmują:

• Doskonała wydajność z prostym liniowym skalowaniem: 5,5 ml próbki na zestaw daje 0.5 - 1 mg białka przy niskich kosztach
• Sprawdzona ekspresja dla różnych białek o wysokiej rozpuszczalności, w tym kinaz, enzymów, transporterów, receptorów, białek GPCR, białek multimerycznych i kompleksów oraz białek toksycznych o masie od 10 kDa do ponad 220 kDa
• Szybka ekspresja białek w ciągu zaledwie kilku godzin dzięki wyeliminowaniu potrzeby klonowania i hodowli komórkowej oraz braku wymogu optymalizacji kodonów, nawet w przypadku ekspresji transkryptów o wysokiej zawartości A/T lub G/C
• Otwarty system odpowiedni do dodawania naturalnych lub nienaturalnych składników do mieszaniny reakcyjnej i idealny do znakowania białek

Rysunek 2. Analiza Western blot różnych białek wytworzonych przy użyciu zestawu Next Generation Cell Free Protein Expression Kit (Wheat Germ) nr kat. Nr kat. CFPS700. Białka wykryto za pomocą przeciwciała znakującego, takiego jak przeciwciało anty-Flag.

Publikowane badanie z wykorzystaniem naszego systemu ekspresji białek bez komórek

Ze względu na wysoką wydajność białka i łatwy w użyciu format, system CFPE (kiełki pszenicy) został wybrany jako najbardziej odpowiedni do kompleksowego badania ekspresji białek w projekcie "Human Protein Factory" w National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) w Japonii.

W tym badaniu, opublikowanym w Nature Methods, naukowcy podjęli próbę ekspresji 13 364 ludzkich białek i oceny ich aktywności biologicznej w dwóch kategoriach funkcjonalnych. Spośród nich 12996 klonów (97,2%) wytworzyło białko w zestawie CFPS700, a 77% z 75 testowanych fosfataz wykazało aktywność biologiczną.

Zestaw CFPS700 zawiera kilka ulepszeń produktu. Na przykład, dodanie opatentowanego 3' wzmacniacza krótkiej translacji URT (STE) sprawia, że transkrybowane mRNA jest bardziej stabilne, co skutkuje wyższą wydajnością białka i eliminuje potrzebę klonowania. Ponadto, nasza znacznie ulepszona metoda ekstrakcji z kiełków pszenicy sprawia, że lizat ekstraktu jest wyższej jakości i ma lepszą spójność działania.

Aby osiągnąć wysoką wydajność białek rekombinowanych o jakości badawczej, jednocześnie korzystając z łatwego w użyciu formatu w konkurencyjnej cenie, nie szukaj dalej niż zestaw do ekspresji białek bezkomórkowych nowej generacji (kiełki pszenicy) (nr kat. CFPS700), aby usprawnić swoje badania, niezależnie od dalszych zastosowań.

ALiCE^®.Zestaw do bezkomórkowej ekspresji białek (lizat komórek roślinnych)

Zestaw ALiCE^® jest unikalnym, bezkomórkowym systemem eukariotycznym, który wykorzystuje lizat komórkowy pochodzący z komórek roślinnych. W porównaniu z innymi systemami bezkomórkowymi eukariotycznymi dostępnymi na rynku, które zwykle dają 0,1 mg/ml lub mniej, lub systemami bezkomórkowymi prokariotycznymi o wydajności do 1 mg/ml, zestaw ALiCE^® daje bezprecedensowe 3 mg/ml białka w trybie wsadowym. Siła zestawu ALiCE^® leży w jego nienaruszonych organellach, z aktywnymi mitochondriami zapewniającymi ciągłe dostawy energii. Dodatkowo, mikrosomy (retikulum endoplazmatyczne przekształcone w naczynia) umożliwiają fałdowanie i potranslacyjne modyfikacje złożonych białek, w tym wiązań dwusiarczkowych i glikozylacji. Dodatkowe zalety zestawu ALiCE^® obejmują:

• Do 30 razy więcej białka w konkurencyjnych cenach rynkowych
• Zwalidowany już dla ponad 500 białek
• Uproszczony przepływ pracy pozwala na minimalne manipulacje w celu rozpoczęcia reakcji, a dołączone detergenty ułatwiają odzyskiwanie białek (w tym białek znajdujących się w mikrosomach).

Rysunek 3. Ekspresja GLuc. Lucyferaza Gaussia princeps jest białkiem kulistym (19 kDa), a jej aktywna forma ma pięć wiązań dwusiarczkowych. Białko było kierowane do mikrosomów i wytwarzane przez 48 godzin w temperaturze 25 °C, 70% wilgotności względnej, 500 obr/min i oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa His-Tag. Oznaczanie aktywności przeprowadzono z katalizą utleniania koelenerazyny do koelenteramidu w reakcji emitującej światło (lambda em) = 475 nm. Lucyferaza została zagęszczona podczas oczyszczania, co skutkowało wyższymi arbitralnymi wartościami luminescencji.

Zestaw do bezkomórkowej ekspresji białek ALiCE^® Cell Free Protein Expression Kit (AL0103000) to radykalnie odmienne podejście do bezkomórkowej ekspresji i platforma niepodobna do żadnej innej. Co ważne, obecne procesy ekspresji bezkomórkowej można łatwo przetłumaczyć na system ALiCE^® . Zestaw do bezkomórkowej ekspresji białek ALiCE^® (AL0103000) jest od lat stosowany w Corteva Agriscience, oddziale agrobio DowDuPont™, a także Fraunhofer IME do ekspresji ponad 500 białek różnego typu. Pokazuje to, że zestaw ALiCE^® ma zastosowanie do każdego celu, czy to do biofarmaceutyków, enzymów technicznych, rozwoju upraw, szlaków metabolicznych, badań podstawowych itp. Zestaw ALiCE^® został z powodzeniem wykorzystany do ekspresji białek reporterowych, antygenów, przeciwciał scFv, alergenów, hormonów, pełnowymiarowych Abs i białek błonowych.

ALiCE^® jest zastrzeżonym znakiem towarowym LenioBio GmbH w Niemczech.

Limited Use Label License for Research Only