Testy wykrywania niedotlenienia
Pomiar poziomu tlenu w tkankach i komórkach
Definiowana jako niedobór tlenu w tkankach, hipoksja jest cechą charakterystyczną guzów pierwotnych, która występuje z powodu upośledzonej naczynia krwionośne oraz zwiększone zapotrzebowanie oddechowe szybko proliferujących komórek nowotworowych. Z naczyniami włosowatymi skoncentrowanymi na obrzeżach, mikrośrodowisko guza generuje gradient tlenu z niskim [O2] w pobliżu nekrotycznego rdzenia i wysokim [O2] na powierzchni guza (Rysunek 1). Niedotlenienie wpływa na wiele aspektów choroby przerzutowej, w tym proliferację komórek, zdolność metaboliczną, odpowiedź immunologiczną i oporność na interwencję chemioterapeutyczną. Na poziomie komórkowym w odpowiedzi na niedotlenienie pośredniczą czynniki transkrypcyjne indukowane hipoksją (HIF), które regulują ekspresję genów napędzających adaptację komórek rezydentnych. Odkrycie mechanizmów leżących u podstaw odpowiedzi na niedotlenienie ma kluczowe znaczenie dla rozwoju środków terapeutycznych ukierunkowanych na progresję nowotworu. Oferujemy różnorodne zestawy do wykrywania niedotlenienia i testy do pomiaru poziomu tlenu zarówno w utrwalonych, jak i żywych komórkach i tkankach.
Rysunek 1.Niedotlenione mikrośrodowisko guza. Guzy lite szybko przerastają swoje ukrwienie, pozostawiając obszary guza o stężeniach tlenu znacznie niższych niż te występujące w zdrowych tkankach. Warunki niedotlenienia prowadzą do powstawania komórek nowotworowych o zwiększonym wskaźniku mutacji, wypływu leków i unikania apoptozy, a także zmniejszonej ogólnej proliferacji komórek, rozpuszczalności leków i wydzielania rozpuszczalnych cytokin i składników odżywczych.
Pomiar poziomu tlenu w utrwalonych tkankach i komórkach
Zidentyfikowano kilka markerów do wykrywania niedotlenienia za pomocą obrazowania i są one szeroko stosowane w badaniach. Opracowany na Uniwersytecie Pensylwanii przez Kocha i Evansa, EF5 (cząsteczka oparta na 2-nitroimidazolu) selektywnie identyfikuje komórki niedotlenione. Po wstrzyknięciu do utrwalonych tkanek EF5 selektywnie wiąże się z niedotlenionymi komórkami i tworzy addukty. Fluorescencyjnie sprzężone mysie przeciwciało monoklonalne może być następnie użyte do selektywnego wiązania i identyfikacji adduktów EF5, sygnalizując środowisko niedotlenienia (Rysunek 2). Oferujemy kompletne, gotowe do użycia zestawy i samodzielne odczynniki do wykrywania niedotlenienia EF5, w tym sprzężone przeciwciała EF5, bufory i związki EF5.
Kluczowe zalety zestawu do wykrywania niedotlenienia EF5:
- W przeciwieństwie do pimonidazolu, pojedyncza lipofilowa forma EF5 ułatwia szybką i równomierną dystrybucję w tkankach
- Kalibracja obrazów wiązania EF5 zapewnia ilościowe wartości pO2 dla każdej komórki
- Wysoko cytowany w ponad 2000 publikacjach
Rysunek 2. Wykrywanie niedotlenienia w utrwalonej tkance.Ludzka skóra wykazująca związek między wiązaniem EF5 (czerwony, rysunki A i B) a naczyniami krwionośnymi (zielony, CD31; rysunek A) lub proliferującymi komórkami (zielony; Ki67 - rysunek B).
Wykrywanie niedotlenienia żywych komórek
Niedotlenienie w żywej tkance jest skorelowane z kilkoma patologiami, w tym rakiem i niedokrwieniem. Istniejące sondy do wykrywania hipoksji, takie jak pimonidazol i EF5, wymagają utrwalenia komórek, a następnie barwienia immunologicznego. BioTracker 520 Green Hypoxia Dye to fluorescencyjna sonda obrazująca do wykrywania niedotlenienia w żywych komórkach (Rysunek 3). Dzięki czułości porównywalnej z pimonidazolem, barwnik hipoksji BioTracker może być stosowany w obrazowaniu fluorescencyjnym żywych komórek i cytometrii przepływowej (Rysunki 4 i 5).
Obrazowanie hipoksji żywych komórek w komórkach nowotworowych przy użyciu systemu mikroprzepływowego CellASIC® ONIX2
Rysunek 3. Mechanizm działania barwnika niedotlenienia BioTracker.Redukcyjne rozszczepienie zasady azowej w BioTracker 520 Green Hypoxia Dye zachodzi w warunkach niedotlenienia, generując 2Me RG, który emituje jasnozieloną fluorescencję. Niższe poziomy tlenu (cięższe warunki niedotlenienia) prowadzą do większej intensywności fluorescencji.
Rysunek 4. Pomiar niedotlenienia w komórkach nowotworowych.Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek A549 poddanych działaniu malejących stężeń tlenu przy użyciu zielonego barwnika hipoksji BioTracker 520.
Rysunek 5. Wykrywanie niedotlenienia za pomocą cytometrii przepływowej.Komórki A549 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej po inkubacji przez 6 godzin w różnych stężeniach tlenu i barwiono 1 μM BioTracker 520 Green Hypoxia Dye. Intensywność fluorescencji wzrastała wraz ze spadkiem stężenia tlenu, co wskazuje, że barwnik jest skuteczną sondą do wykrywania niedotlenienia za pomocą cytometrii przepływowej.
Microfluidic Control of Hypoxic Microenvironments
Platforma obrazowania CellASICONIX2 kontroluje perfuzję mediów, wymianę gazową i temperaturę w jednym urządzeniu do zautomatyzowanej, długoterminowej hodowli komórek z ciągłym obrazowaniem żywych komórek.Ta innowacyjna konstrukcja pozwala na ekspozycję komórek na różne warunki środowiskowe poprzez kanały przepływu pod ciśnieniem i kontrolę parametrów hodowli, z określonymi przez użytkownika zmianami źródła mediów i szybkości przepływu.
Jednostka hodowlana składa się z płytki mikroprzepływowej i systemu kontroli środowiska (rysunek 6). Płytki są zbudowane z materiałów przepuszczających gaz i kanałów napowietrzających, minimalizując efekty dyfuzyjne. Hodowle mikroobjętościowe pozwalają na bardziej precyzyjną kontrolę chemiczno-czasową i przestrzenną, w tym szybkie zmiany warunków eksperymentalnych. Sterownik reguluje ładowanie komórek pod ciśnieniem, programowalną perfuzję mediów, temperaturę i poziomy gazu. Dzięki niewielkim rozmiarom i wysokiej przejrzystości optycznej płytkę można sparować z większością mikroskopów odwróconych w celu zautomatyzowanej analizy dynamicznej. W połączeniu z wizualizacją fluorescencyjną, ONIX2 może być używany do monitorowania zmian w ekspresji znakowanych białek (rysunki 7 i 8) oraz do rozróżniania i analizowania wielu typów komórek jednocześnie.
Rysunek 6.Schemat systemu obrazowania CellASIC
Rysunek 7. Chemooporność zmienia równolegle poziomy białka HIF1α.A) Podczas kondycjonowania hipoksyjnego i przywracania normoksji komórki utrwalono i wybarwiono w celu identyfikacji wszystkich komórek i frakcji reagującej na hipoksję. B) Poziomy Hif1α korelowały ze zmianami chemiooporności, osiągając szczyt po 4 godzinach z przedłużoną ekspozycją na niedotlenienie. Znormalizowana intensywność fluorescencji wszystkich komórek (DAPI) i frakcji reagującej na hipoksję (Hif1α) (oba obrazy 20x).
Rysunek 8. Odpowiedzi linii komórek nowotworowych na niedotlenienie.Osiem linii komórek nowotworowych (MDA-MB-231, M4A4, MCF7, HT1080, A549, A431, HeLa, HCT116) o różnym pochodzeniu tkankowym i różnym potencjale przerzutowym poddano wstępnemu kondycjonowaniu w warunkach niedotlenienia (z przywróceniem lub bez przywrócenia standardowego poziomu tlenu) i wystawiono na działanie środka cytotoksycznego - staurosporyny (STX).
Wnioski
Wiadomo, że hipoksja wpływa na wiele funkcji i procesów komórek nowotworowych, w tym proliferację komórek, oporność na środki cytotoksyczne, mechanizmy śmierci komórek i potencjał przerzutowy. Dalsze wyjaśnienie mechanizmów i procesów niedotlenienia pozwoli badaczom zapobiegać progresji raka i opracowywać skuteczniejsze i solidniejsze chemioterapeutyki. Niezależnie od podejścia eksperymentalnego, jesteśmy zaangażowani w pomoc w rozwiązywaniu najtrudniejszych problemów w naukach przyrodniczych poprzez przyspieszenie dostępu do innowacyjnych metod i materiałów. Od utrwalonych tkanek do obrazowania żywych komórek, mamy odczynniki, narzędzia i instrumenty, aby przyspieszyć badania nad niedotlenieniem w raku i innych stanach chorobowych.
Odniesienie
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?