Fluorescencyjne sondy retinoidowe

Fluorescencyjne analogi kwasu retinowego do stosowania w obrazowaniu komórkowym, testach wiązania białko-ligand i cytometrii przepływowej

Wprowadzenie do fluorescencyjnych sond retinoidowych

Fluorescencyjne sondy retinoidowe LightOx  (Rysunek 1) to rodzina syntetycznych analogów kwasu all-trans-retinowego (ATRA), które wykazują silną fluorescencję solwatochromatyczną po wzbudzeniu światłem UV/fioletowym.¹ W szeregu testów biologicznych fluorescencyjne sondy retinoidowe LightOx wykazują porównywalną, a w niektórych przypadkach silniejszą aktywność biologiczną niż ATRA i dlatego mogą być stosowane jako skuteczne zamienniki ATRA w szerokim zakresie testów, zwłaszcza tych z udziałem receptorów kwasu retinowego (RAR).^2-5 LightOx17 (Rysunek 2) jest dłuższy niż inne analogi i nie wykazuje aktywności retinoidowej i jest dostarczany jako nieaktywna biologicznie sonda fluorescencyjna o podobnych właściwościach do innych pochodnych retinoidów.

Rysunek 1. Struktury chemiczne fluorescencyjnych sond retinoidowych LightOx.

Rysunek 2. Struktura chemiczna niebioaktywnej fluorescencyjnej sondy retinoidowej LightOx.

Właściwości fotofizyczne

Fluorescencyjne sondy retinoidowe LightOx mogą być wzbudzane przez typowe źródła światła UV-A (np. zestaw filtrów DAPI) i fioletowego (405 nm). Emisja fluorescencji jest łatwo wykrywana w środowisku komórkowym przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, w eksperymentach kuwetowych przy użyciu spektrofotometru oraz w formacie płytek dołkowych przy użyciu typowych czytników płytek.

Charakterystyka absorpcji i emisji jest wysoce solwatochromatyczna (Rysunki 3-4). W szczególności długość fali i intensywność emisji są silnie zależne od lokalnego środowiska: intensywne i przesunięte w kierunku niebieskim w środowiskach niepolarnych oraz słabsze i przesunięte w kierunku czerwonym w środowiskach polarnych. Na przykład w eksperymentach mikroskopowych umożliwia to pozyskiwanie informacji o środowisku oprócz zachowania lokalizacyjnego.¹

Rysunek 3. Widma absorpcyjne LightOx14 w różnych rozpuszczalnikach.

Rysunek 4. Widma emisji fluorescencji LightOx14 w różnych rozpuszczalnikach.

Właściwości wiązania białek retinoidowych

Większość fluorescencyjnych sond retinoidowych LightOx wykazuje wysokie powinowactwo wiązania białek wiążących retinoidy, w tym receptorów kwasu retinowego (RAR) i komórkowego białka wiążącego kwas retinowy II (CRABPII) (Tabela 1) z wyjątkiem LightOx17, który nie jest białkiem wiążącym RAR. To silne wiązanie można wykorzystać do opracowania konkurencyjnych fluorometrycznych testów wiązania, w których przemieszczenie fluorescencyjnego retinoidu z docelowego białka można monitorować za pomocą emisji fluorescencji i wykorzystać do określenia względnego powinowactwa wiązania konkurencyjnego ligandu.

Tabela 1. Stałe dysocjacji, Kd, określone poprzez fluorometryczne miareczkowanie fluorescencyjnych retinoidów względem komórkowego białka wiążącego kwas retinowy II (CRABPII).

Fluorescencyjna sonda retinoidowa	CRABPII Kd/nM
LightOx14	49.1 ± 2,6
LightOx17	≥875.0 ± 118.4
LightOx19	34.0 ± 2.5
LightOx21	124.8 ± 4.3
LightOx22	94.0 ± 3.7
LightOx23	385.4 ± 28.5
LightOx25	88.3 ± 2.1
LightOx26	51.6 ± 3.2

Rysunek 5. Znakowanie żywych komórek keratynocytów naskórka HaCaT za pomocą LightOx14. Komórki w lewym i prawym panelu były znakowane przez 60 minut przed obrazowaniem. Po lewej: Znakowanie jądrowe za pomocą LightOx14 wykryte w małych skupiskach komórek proliferacyjnych. Po prawej: LightOx14 wykryty w przedziałach cytoplazmatycznych i jądrowych w częściowo zróżnicowanych komórkach.

Instrukcje przygotowania

Fluorescencyjne sondy retinoidowe LightOx są wysoce rozpuszczalne w DMSO i mogą być przygotowywane jako roztwór podstawowy do stężenia 10 mM.

Przechowywanie i stabilność

Fluorescencyjne sondy retinoidowe LightOx są stabilne w świetle i nie wymagają specjalnych środków ostrożności podczas stosowania. Roztwory w DMSO powinny być przechowywane w temperaturze od 4 do -20 ^oC w ciemności, a ich okres trwałości wynosi około 6 do 12 miesięcy.

Bezpieczeństwo i utylizacja

Próbki przed utylizacją należy poddać działaniu wybielacza.

Referencje

1. Chisholm DR, Tomlinson CWE, Zhou G, Holden C, Affleck V, Lamb R, Newling K, Ashton P, Valentine R, Redfern C, et al. 2019. Fluorescent Retinoic Acid Analogues as Probes for Biochemical and Intracellular Characterization of Retinoid Signaling Pathways. ACS Chem. Biol.. 14(3):369-377. https://doi.org/10.1021/acschembio.8b00916

2. Tomlinson CWE, Chisholm DR, Valentine R, Whiting A, Pohl E. 2018. Novel Fluorescence Competition Assay for Retinoic Acid Binding Proteins. ACS Med. Chem. Lett.. 9(12):1297-1300. https://doi.org/10.1021/acsmedchemlett.8b00420

3. Khatib T, Whiting A, Chisholm DR, Redfern C, Müller B, McCaffery P. 2019. A Bioluminescence Reporter Assay for Retinoic Acid Control of Translation of the GluR1 Subunit of the AMPA Glutamate Receptor. Mol Neurobiol. 56(10):7074-7084. https://doi.org/10.1007/s12035-019-1571-9

4. Khatib T, Marini P, Nunna S, Chisholm DR, Whiting A, Redfern C, Greig IR, McCaffery P. 2019. Genomic and non-genomic pathways are both crucial for peak induction of neurite outgrowth by retinoids. Cell Commun Signal. 17(1): https://doi.org/10.1186/s12964-019-0352-4

5. Zolfaghari R, Mattie FJ, Wei C, Chisholm DR, Whiting A, Ross AC. 2019. CYP26A1 gene promoter is a useful tool for reporting RAR-mediated retinoid activity. Analytical Biochemistry. 57798-109. https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.04.022

Informacje kontaktowe

Aby uzyskać najnowsze informacje odwiedź https://lightox.co.uk/imaging-probes/.

.