Pomiar czasu życia fluorescencji

Wprowadzenie

Czas życia fluorescencji (FLT) to czas, jaki fluorofor spędza w stanie wzbudzonym przed emisją fotonu i powrotem do stanu podstawowego. FLT może wahać się od pikosekund do setek nanosekund w zależności od fluoroforu.

Czas życia populacji fluoroforów to czas mierzony dla liczby wzbudzonych cząsteczek do wykładniczego rozpadu do N/e (36.8%) pierwotnej populacji poprzez utratę energii w wyniku fluorescencji lub procesów nieradiacyjnych.

Czas życia fluorescencji jest nieodłączną właściwością fluoroforu. FLT nie zależy od stężenia fluoroforu, absorpcji przez próbkę, grubości próbki, metody pomiaru, intensywności fluorescencji, fotowybielania i/lub intensywności wzbudzenia. Wpływają na niego czynniki zewnętrzne, takie jak temperatura, polaryzacja i obecność wygaszaczy fluorescencji. Czas życia fluorescencji jest wrażliwy na czynniki wewnętrzne, które zależą od struktury fluoroforu.¹

Metody określania czasu życia fluorescencji fluoroforów

Czas życia fluorescencji można mierzyć w dziedzinie częstotliwości lub w dziedzinie czasu.

Metoda w dziedzinie czasu polega na oświetleniu próbki (kuwety, komórek lub tkanki) krótkim impulsem światła, a następnie pomiarze intensywności emisji w funkcji czasu. FLT jest określana na podstawie nachylenia krzywej zaniku. Dostępnych jest kilka metod detekcji fluorescencji do pomiarów czasu życia, z których skorelowane z czasem zliczanie pojedynczych fotonów (TCSPC)  umożliwia proste gromadzenie danych i ulepszone ilościowe zliczanie fotonów.

Metoda domeny częstotliwości obejmuje sinusoidalną modulację padającego światła przy wysokich częstotliwościach. W tej metodzie emisja zachodzi przy tej samej częstotliwości, co światło padające, czemu towarzyszy opóźnienie fazowe i zmiana amplitudy w stosunku do światła wzbudzającego (demodulacja).

Zalety pomiaru czasu życia fluorescencji w porównaniu z pomiarem opartym na intensywności²

1. Pomiary czasu życia nie wymagają sond o współczynniku długości fali, aby zapewnić ilościowe oznaczenie wielu analitów.
2. Metoda czasu życia rozszerza czułość zakresu stężenia analitu poprzez zastosowanie sond z przesunięciami widmowymi.
3. Pomiary czasu życia mogą być stosowane dla analitów, dla których nie ma bezpośrednich sond. Anality te obejmują glukozę, antygeny lub wszelkie testy powinowactwa lub immunologiczne oparte na mechanizmie transdukcji transferu energii fluorescencji.

Zastosowania

Testy czasu życia fluorescencji:

Czas życia fluorescencji jest solidnym parametrem do wykorzystania w wielu testach biologicznych. Może on potencjalnie zastąpić konwencjonalne techniki pomiarowe, takie jak absorpcja, luminescencja lub intensywność fluorescencji.³ Każda zmiana w środowisku fizykochemicznym fluoroforu prowadzi do zmian w czasie życia fluorescencji. Testy oparte na czasie życia można opracować, wykorzystując różne mechanizmy, takie jak prosty test wiązania, który obejmuje wiązanie dwóch składników (jeden jest znakowany fluorescencyjnie) w celu wywołania zmiany FLT. Innym mechanizmem jest test typu wygaszanie-wydzielanie, który obejmuje wygaszony gatunek, obecny w dużym nadmiarze, o niskiej, ale skończonej fluorescencji. Po uwolnieniu związku fluorescencyjnego (w wyniku reakcji enzymatycznej lub wiązania z komplementarnym DNA), czas życia układu ulega zmianie. FLT można łączyć z testami FRET (Förster resonance energy transfer) w celu pomiaru wydajności transferu energii.

Fluorescence Lifetime Sensing:

Ta technika opiera się na zmianach czasu życia lub rozpadu sondy. Nanosekundowe (ns) czasy zaniku mogą być mierzone za pomocą modulacji fazy. Technika ta była szeroko stosowana do wykrywania pH, Ca²⁺, K⁺, glukozy i innych metabolitów. Niedawno nastąpił rozwój w zakresie stosowania czujników opartych na czasie życia w tkankach i innych losowych mediach przy użyciu sond optycznych o widmach wzbudzenia i emisji w obszarze bliskiej podczerwieni.^4,5

Fluorescence Lifetime Imaging (FLI):

Ta technika jest stosunkowo nowa i polega na określeniu przestrzennego rozkładu czasów zaniku fluorescencji na każdym pikselu obrazu jednocześnie. Opiera się ona na fakcie, że czas życia fluorescencji fluoroforu zależy od jego środowiska molekularnego, ale nie od jego stężenia. Może być stosowana w mikroskopii fluorescencyjnej, w której nie można kontrolować lokalnego stężenia sondy. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) jest wykorzystywana do pomiaru parametrów środowiska molekularnego, interakcji białek poprzez transfer energii rezonansu Förstera (FRET) oraz stanu metabolicznego komórek i tkanek poprzez ich autofluorescencję. Parametry środowiska molekularnego można mierzyć na podstawie zmian czasu życia wywołanych wygaszaniem fluorescencji lub zmianami konformacji fluoroforów. FLIM może być wykorzystywany w zastosowaniach biologicznych, w tym do skanowania powierzchni tkanek, mapowania typu tkanki, terapii fotodynamicznej, analizy chipów DNA, obrazowania skóry itp.⁶

Słabe emitery mają krótsze czasy życia fluorescencji, podczas gdy fluorofory o dłuższych czasach życia mają niskie współczynniki rotacji fotonów. Nie są one zbyt użyteczne w obrazowaniu czasu życia ze względu na ich ograniczoną czułość i konieczność długiego czasu ekspozycji i akwizycji.

Różne klasy cząsteczek fluorescencyjnych i sond powszechnie stosowanych w obrazowaniu czasu życia są wymienione poniżej:

Cząsteczki fluorescencyjne i sondy fluorescencyjne są powszechnie stosowane w obrazowaniu czasu życia.

Referencje

1. Berezin MY, Achilefu S. 2010. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.. 110(5):2641-2684. https://doi.org/10.1021/cr900343z

2. Szmacinski H, Lakowicz JR. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing and imaging. Sensors and Actuators B: Chemical. 29(1-3):16-24. https://doi.org/10.1016/0925-4005(95)01658-9

3. Doering K, Meder G, Hinnenberger M, Woelcke J, Mayr LM, Hassiepen U. 2009. A Fluorescence Lifetime-Based Assay for Protease Inhibitor Profiling on Human Kallikrein 7. J Biomol Screen. 14(1):1-9. https://doi.org/10.1177/1087057108327328

4. Lakowicz JR. 1994. Topics in Fluorescence Spectroscopy. https://doi.org/10.1007/b112911

5. Hutchinson C, Lakowicz J, Sevick-Muraca E. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing in tissues: a computational study. Biophysical Journal. 68(4):1574-1582. https://doi.org/10.1016/s0006-3495(95)80330-9

6. Clegg RM, Holub O, Gohlke C. 2003. [22] Fluorescence lifetime-resolved imaging: Measuring lifetimes in an image.509-542. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(03)60126-6