Jak działają testy ligacji zbliżeniowej (PLA)?
Duolink® Proximity Ligation Assay
Duolink® Proximity Ligation Assay (PLA) to potężne narzędzie, które umożliwia wykrywanie in situ endogennych białek, modyfikacji białek i interakcji białek z wysoką specyficznością i czułością. Cele białkowe mogą być łatwo wykrywane i lokalizowane z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki w niezmodyfikowanych komórkach i tkankach. Zazwyczaj dwa pierwotne przeciwciała hodowane w różnych gatunkach są używane do wykrywania dwóch unikalnych docelowych białek (rysunek 1A). Para znakowanych oligonukleotydami przeciwciał drugorzędowych (sondy PLA) wiąże się następnie z przeciwciałami pierwszorzędowymi (rysunek 1B). Następnie hybrydyzujące oligo przyłącza się do sond PLA tylko wtedy, gdy znajdują się one w bliskiej odległości od siebie, a ligaza tworzy zamkniętą, okrągłą matrycę DNA, która jest wymagana do amplifikacji toczącego się koła (RCA) (rysunek 1C).Sonda PLA działa następnie jako starter dla polimerazy DNA, która generuje sekwencje konkatemeryczne podczas RCA (rysunek 1D). Umożliwia to nawet 1000-krotne wzmocnienie sygnału, który jest nadal związany z sondą PLA, umożliwiając lokalizację sygnału. Wreszcie, znakowane oligo hybrydyzują do komplementarnych sekwencji w amplikonie (rysunek 1E), które są następnie wizualizowane i określane ilościowo jako dyskretne plamki (sygnały PLA) za pomocą analizy obrazu mikroskopowego (rysunek 1F). Duolink® PLA może być wykonywany na przylegających komórkach, preparatach cytospinowych i skrawkach tkanek na szklanych szkiełkach przy użyciu immunofluorescencji (tj. wykrywania koloru zielonego, czerwonego, dalekiej czerwieni lub pomarańczowego) lub immunohistochemii (tj. reakcji katalizowanej peroksydazą). Ponadto, Duolink® PLA może być wykonywany na krwi lub komórkach zawiesiny w celu wykrywania za pomocą cytometrii przepływowej i może być stosowany na płytkach wielodołkowych (np. 96- lub 384-dołkowych) z wywoływarką przesiewową o wysokiej zawartości do analizy o wysokiej przepustowości. Wysoka specyficzność, czułość i wszechstronność Duolink® PLA sprawiają, że jest to idealna metoda do analizy szlaków, kinetyki ekranów leków, określania IC50 i walidacji celów.
Rysunek 1. Schemat reakcji Duolink® PLA.(A) Dwa podstawowe przeciwciała rozpoznają specyficzne białka w komórce. Żółte i zielone kuleczki reprezentują dwa epitopy pojedynczego białka lub epitopy na dwóch różnych białkach, które wchodzą w interakcje. (B) Wtórne przeciwciała połączone z oligonukleotydami (sondy PLA) wiążą się z pierwotnymi przeciwciałami. (C) Gdy sondy PLA znajdują się w bliskiej odległości, oligonukleotydy przyłączają się do sond PLA i ulegają ligacji. (D) Powstała zamknięta, kolista matryca DNA jest amplifikowana przez polimerazę DNA. (E) Komplementarne oligo detekcyjne sprzężone z fluorochromami hybrydyzują z powtarzającymi się sekwencjami w amplikonach. (F) Sygnały PLA są wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej jako dyskretne plamki i zapewniają wewnątrzkomórkową lokalizację białka lub interakcji białka.
Wykrywanie dimeryzacji EGFR i HER2 za pomocą testu ligacji zbliżeniowej Duolink® Proximity Ligation Assay
Dimeryzacja receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, ErbB1, HER1) i ludzkiego receptora naskórkowego 2 (HER2, ErbB2, Neu) jest dobrze znaną interakcją białko-białko (PPI). EGFR i HER2 są członkami rodziny receptorowych kinaz tyrozynowych ErbB, które odgrywają kluczową rolę w regulacji podziału i śmierci komórek. Mutacje, które wpływają na ekspresję lub aktywność któregokolwiek z tych białek, są związane z rozwojem różnych nowotworów. Po związaniu ligandu (np. EGF) z zewnątrzkomórkową domeną EGFR, receptor ulega aktywacji i autofosforyluje swój cytoplazmatyczny ogon. Indukuje to tworzenie homo- (EGFR-EGFR) i hetero- (np. EGFR-HER2) dimerów z innymi członkami rodziny ErbB (Rysunek 2). Dimeryzacja i późniejsza fosforylacja prowadzą do rekrutacji białek adaptorowych, aktywacji wewnątrzkomórkowych kaskad sygnalizacyjnych, a ostatecznie do zmian w transkrypcji genów, które mogą powodować proliferację komórek nowotworowych, angiogenezę, inwazję, przerzuty i zmniejszoną apoptozę.
Rysunek 2. Schemat dimeryzacji EGFR-HER2.Ligandy, takie jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), wiążą się z zewnątrzkomórkową domeną EGFR, powodując aktywację i autofosforylację. To z kolei skutkuje homodimeryzacją EGFR (nie przedstawiono) lub heterodimeryzacją z innymi członkami rodziny ErbB, takimi jak HER2. Dimeryzacja i późniejsza fosforylacja prowadzą do aktywacji dalszych szlaków sygnałowych. Źródło obrazu: Lancet Oncol. 16(15):e543-e554.
Duolink® PLA Control Kit - PPI Confirms Your Experiment is Working
Komórki ludzkiego raka jajnika SK-OV3 wykazują umiarkowany do wysokiego poziom EGFR i HER2. Aby potwierdzić in situ wykrycie indukowanej przez EGF dimeryzacji EGFR-HER2, użyto zestawu Duolink® PLA Control Kit - PPI. Każdy zestaw zawiera dwa 8-dołkowe szkiełka komorowe ze wstępnie utrwalonymi komórkami SKOV3 poddanymi działaniu EGF oraz mysimi przeciwciałami pierwotnymi anty-EGFR i króliczymi przeciwciałami anty-HER2. Optymalne stężenia przeciwciał pierwotnych zostały już określone, a zalecenia znajdują się w dokumentacji dołączonej do produktu. Po nawodnieniu w 1x PBS, komórki były permeabilizowane 0,2% Tritonem X-100 w 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie blokowane przez 1 godzinę w 37 °C przy użyciu buforu blokującego Duolink® PLA. Komórki w zduplikowanych dołkach inkubowano następnie z obydwoma pierwotnymi przeciwciałami. Techniczne kontrole negatywne obejmowały inkubację z każdym pierwotnym przeciwciałem oddzielnie i bez pierwotnego przeciwciała, przeprowadzoną na zduplikowanych studzienkach (Rysunek 3). Po przemyciu, Duolink® PLA przeprowadzono zgodnie z Protokół fluorescencji Duolink® PLA. Wszystkie studzienki inkubowano z Duolink® anti-rabbit PLUS i anti-mouse MINUSDuolink® In Situ Detection Reagent FarRed. Szkiełka zostały zamontowane przy użyciu Duolink® In Situ Mounting Media with DAPI a obrazy uzyskano przy użyciu GE IN Cell Analyzer 2200.
Rysunek 3. Zestaw kontrolny Duolink® PLA - układ szkiełka PPI i umieszczenie próbki.Wszystkie studzienki zawierają stymulowane EGF, wstępnie utrwalone komórki SK-OV3. Po permeabilizacji i zablokowaniu, studzienki 1 i 5 inkubowano zarówno z króliczymi przeciwciałami anty-EGFR, jak i mysimi przeciwciałami anty-HER2, studzienki 2 i 6 inkubowano z samym przeciwciałem anty-EGFR, studzienki 3 i 7 inkubowano z samym przeciwciałem anty-HER2, a studzienki 4 i 8 inkubowano tylko z rozcieńczalnikiem przeciwciał.
Podobne wyniki PLA uzyskano, gdy pierwotne przeciwciała inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (Rysunek 4A-4D) lub przez noc w temperaturze 4 °C (Rysunek 4E-4H), co zapewnia użytkownikowi większą elastyczność. Silny sygnał PLA wykryto w aktywowanych EGF komórkach SK-OV3, gdy obecne były zarówno pierwotne przeciwciała anty-EGFR, jak i anty-HER2, co wskazuje na obfite kompleksy EGFR:HER2 (Rysunek 4A, 4E). Pomimo jednolitego traktowania komórek SK-OV3 EGF, liczba sygnałów PLA/kompleksów EGFR:HER2 różniła się między komórkami. Jest to prawdopodobnie spowodowane zróżnicowaną ekspresją HER2 w populacji komórek SK-OV3 (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do tego, wykryto bardzo niewiele sygnałów PLA, gdy zastosowano tylko jedno przeciwciało pierwotne lub gdy oba przeciwciała pierwotne zostały pominięte (Rysunek 4B-D, 4F-H). Należy zauważyć, że zbyt wysokie stężenia przeciwciał pierwotnych mogą prowadzić do zwiększonej liczby sygnałów PLA, gdy są stosowane oddzielnie i/lub mogą prowadzić do koalescencji dodatnich sygnałów PLA, których nie można dokładnie określić ilościowo (dane nie pokazane). Dlatego ważne jest, aby stosować zalecane stężenia przeciwciał pierwotnych. Łącznie dane te pokazują, że kompleksy EGFR:HER2 mogą być wykrywane i oznaczane ilościowo w komórkach SK-OV3 stymulowanych EGF przy użyciu Duolink® PLA Control Kit - PPI.
Rysunek 4. Wykrywanie dimeryzacji EGFR:HER2 indukowanej przez EGF przy użyciu Duolink® PLA.Szkiełka utrwalonych komórek SK-OV3 poddanych działaniu EGF inkubowano z mysimi przeciwciałami anty-EGFR i króliczymi przeciwciałami anty-HER2 (A, E), tylko z przeciwciałami anty-EGFR (B, F), tylko z przeciwciałami anty-HER2 (C, G) lub z samym rozcieńczalnikiem przeciwciał (D, H) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (A-D) lub przez noc w temperaturze 4 °C (E-H). Następnie wykonano Duolink® PLA przy użyciu sond PLA anty-rabbit PLUS i anty-mouse MINUS. Dziesięć losowych obrazów 20x na studzienkę uzyskano przy użyciu filtrów DAPI (niebieskie jądra) i Cy5 (czerwone sygnały PLA). Obrazy są reprezentatywne dla co najmniej 5 niezależnych eksperymentów.
Formaty detekcji białek dla produktów Duolink® Produkty PLA
Produkty Duolink® PLA są dostępne dla fluorescencji i jasnego pola. Odczynniki fluorescencyjne Duolink® PLA mogą być obecnie stosowane zarówno w mikroskopii, jak i cytometrii przepływowej.
Detekcja fluorescencji
Mikroskopia fluorescencyjna jest najczęściej używanym formatem aplikacji dla eksperymentów Duolink® PLA. Znaczna część protokołu jest taka sama w przypadku stosowania odczynników fluorescencyjnych Duolink® PLA jak w przypadku tradycyjnej immunofluorescencji (IF), jednak technologia Duolink® PLA wykazuje większą specyficzność i wszechstronność niż IF. Dodatkowy etap amplifikacji zawarty w procedurze Duolink® PLA zapewnia większą czułość.
Detekcja jasnego pola
Podobnie jak w przypadku tradycyjnej immunohistochemii (IHC), Brightfield Duolink® PLA jest stosowany głównie na utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawkach tkanek, ale jest kompatybilny z innymi rodzajami próbek.Odczynniki do wykrywania PLA Brightfield Duolink® PLA zawierają oligonukleotydy znakowane peroksydazą chrzanową (HRP), która w obecności substratu HRP tworzy enzym:substratu widoczny pod mikroskopem świetlnym.
Cytometria przepływowa
Duolink® Flow PLA Kit to szybkie, wydajne narzędzie do analizy statystycznej. Zestaw ten identyfikuje interakcje białko-białko lub lokalizację subkomórkową. Połączenie Duolink® PLA z cytometrią przepływową pozwala na gromadzenie danych ilościowych w sposób wysokowydajny.
Jak rozpocząć pracę z technologią Duolink® PLA
Zestaw startowy Duolink® PLA zawiera wszystkie niezbędne odczynniki potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu Duolink® PLA. PLA Starter Kit zawiera wszystkie niezbędne odczynniki potrzebne do przeprowadzenia eksperymentu Duolink® PLA i przeanalizowania do 30 próbek. Wszystko, co musisz zapewnić, to przygotowane komórki lub próbki tkanek, pierwotne przeciwciała i zwykły sprzęt laboratoryjny.
A Duolink® PLA Starter Kit zawiera:
- Dwie sondy PLA: jedną PLUS i jedną MINUS (dopasowane do gospodarza przeciwciał pierwotnych)
- Rozcieńczalnik przeciwciał i bufor blokujący
- Odczynnik do detekcji: wybór czerwony lub pomarańczowy
- Bufor do amplifikacji i enzym polimerazy
- Bufor do ligacji i enzym ligaza
- Bufory do płukania A i B
- Podłoże do montażu z DAPI
Oprócz Duolink® PLA Protocols for&Fluorescence, Brightfield i cytometrii przepływowej, koniecznie odwiedź nasze Centrum zasobów aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego, jak pomyślnie skonfigurować i przeprowadzić eksperyment Duolink® PLA, w tym:
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?