Protokoły dla Fmoc SPPS peptydów zawierających cysteinę

Peptydy zawierające Cys mogą występować w postaci zredukowanej (sulfhydrylowej) lub utlenionej między/ wewnątrzłańcuchowej z wiązaniami disulfidowymi. Synteza peptydów zawierających Cys stanowi zatem szczególne wyzwanie dla chemików peptydów. Staranne zaplanowanie strategii syntezy jest niezbędne, jeśli peptyd o prawidłowej strukturze ma być otrzymany z dobrą wydajnością. Wybór najbardziej odpowiedniej grupy sulfhydrylowej ma ogromne znaczenie, ponieważ "zły" wybór może prowadzić do trudności nie do pokonania podczas syntezy lub późniejszego tworzenia wiązań disulfidowych.

Ważne jest, aby pamiętać, że opisane tutaj procedury są jedynie punktem wyjścia i nie można zagwarantować, że będą działać w każdym przypadku. Problemy zależą od sekwencji i często wymagana jest znaczna optymalizacja warunków reakcji. Jeśli pojawią się trudności, nasz serwis techniczny chętnie pomoże, gdy tylko będzie to możliwe. Aby zapoznać się z dyskusjami na temat zarządzania peptydami zawierającymi cysteinę, wraz ze szczegółowymi protokołami praktycznymi, patrz odniesienie.¹

Ochrona cysteinylowa

Dostępna jest szeroka gama cysteinylowych grup ochronnych do stosowania w Fmoc SPPS (synteza peptydów w fazie stałej). Wybór zależy od charakteru pożądanego peptydu i strategii syntetycznej. Podsumowanie tiolowych grup ochronnych powszechnie stosowanych w Fmoc SPPS (Tabela 1).

Do rutynowej syntezy peptydu cysteinylowego zawierającego wolne grupy tiolowe, szczególnie zalecana jest grupa tritylowa, ponieważ jest ona labilna wobec TFA (kwasu trifluorooctowego) i dlatego jest usuwana podczas normalnej procedury rozszczepiania. Peptyd jest początkowo otrzymywany w zredukowanej formie monomerycznej, ale w razie potrzeby może być łatwo przekształcony w dimeryczną lub cykliczną formę związaną disulfidami poprzez utlenianie.

Dla selektywnej modyfikacji grup tiolowych lub tworzenia disulfidów na żywicy, STmp i Mmt są najbardziej użyteczne, ponieważ można je usunąć w warunkach ortogonalnych do standardowych grup zabezpieczających łańcuch boczny stosowanych w Fmoc SPPS.

Wybór grup ochronnych dla selektywnego disiarczku jest mniej prosty, a znalezienie optymalnej kombinacji może wymagać wielu eksperymentów. Szczegółowa dyskusja na ten temat znajduje się poniżej, tworzenie wiązania disiarczkowego poprzez utlenianie chronionych peptydów cysteinylowych.

Tabela 1.

Grupa ochronna	Odczynnik rozszczepiający	Komentarze
Acetamidometyl(Acm)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, RSCl, PhSOPh-CH3SiCl3	Stabilny wobec TFA. Umożliwia oczyszczanie peptydu w postaci chronionej przed uwolnieniem łatwo utleniających się grup tiolowych. Usunięcie Acm i jednoczesne utworzenie wiązania disulfidowego można przeprowadzić przez traktowanie I2 lub Tl3
t-Butyl(tBu)	Hg(II), HF(20 oC), TFA/DMSO, PhSOPh-CH3SiCl3	Stabilny wobec TFA i utleniania jodem. Obróbka z MeSiCl3/PhSOPh usuwa t-Bu i cyklizuje w jednym kroku bez rozerwania istniejących wiązań disiarczkowych. Traktowanie DPDS w kwasie prowadzi do bezpośredniego tworzenia Cys(Pys) w obecności istniejących mostków dwusiarczkowych i Cys(Acm).
Trityl(Trt)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, TFA, I2, Tl3+	Przydatna pochodna do rutynowego stosowania w Fmoc SPPS, ponieważ generuje peptyd sulfhydrylowy bezpośrednio z reakcji rozszczepienia TFA.
Difenylometyl (Dpm)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, TFA, I2, Tl3+	Przydatna pochodna do rutynowego stosowania w Fmoc SPPS, ponieważ generuje peptyd sulfhydrylowy bezpośrednio z reakcji rozszczepienia TFA. Zwykle stosowana w połączeniu z grupą Mmt, ponieważ Dpm nie krwawi podczas usuwania Mmt za pomocą 2% TFA.
Tetrahydropiranyl(Thp)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, TFA, I2, Tl3+	Przydatna pochodna do rutynowego stosowania w Fmoc SPPS, ponieważ generuje peptyd sulfhydrylowy bezpośrednio z reakcji rozszczepienia TFA. Alternatywa dla grupy Trt. Jej zastosowanie powoduje mniejszą racemizację i b-eliminację niż Trt.
t-butylthio(StBu)	RSH, R3P	Stabilny wobec TFA pod warunkiem, że nie są stosowane zmiatacze tiolu. Został użyty w połączeniu z Acm do selektywnego tworzenia dwóch wiązań disiarczkowych. Jednakże, usuwanie jest powolne i STmp jest preferowany do deprotekcji na żywicy.
Trimetoksyfenylotio(STmp)	RSH, R3P	Umiarkowanie stabilny wobec TFA pod warunkiem, że nie są stosowane zmiatacze tiolu. Stosowany w połączeniu z Mmt do selektywnego tworzenia dwóch wiązań dwusiarczkowych na żywicy.
4-metoksytrytyl (Mmt)	2% TFA w DCM, Hg2+, Ag+, I2, Tl3+,	Może być selektywnie usuwany, podczas gdy peptyd pozostaje przyłączony do fazy stałej. Idealny do tworzenia wiązań dwusiarczkowych na żywicy lub modyfikacji łańcucha bocznego Cys.
3-Nitro-2-pirydynosulfenyl(Npys)	RSH, R3P	Stabilny wobec TFA pod warunkiem, że nie są stosowane zmiatacze tiolu. Aktywuje grupy tiolowe w kierunku tworzenia wiązań disiarczkowych. Przydatny do selektywnego przygotowywania mieszanych disulfidów.

Fmoc SPPS z wykorzystaniem chronionych pochodnych cysteiny

W przeciwieństwie do innych aminokwasów chronionych Fmoc, pochodne Cys chronione Fmoc mogą ulegać znacznej racemizacji podczas standardowych reakcji sprzęgania. Problem ten jest szczególnie dotkliwy, gdy do aktywacji karboksylowej stosuje się metody zasadowe, takie jak HBTU/DIPEA. Ogrzewanie mikrofalowe i wstępna aktywacja pogłębiają ten problem. Na szczęście racemizacja jest znikoma, jeśli sprzęganie jest przeprowadzane w warunkach kwaśnych/neutralnych przy użyciu wstępnie uformowanych symetrycznych bezwodników² lub estrów OPfp³ lub z aktywacją DIPCDI/HOBt lub DIPCDI/Oxyma.

Synteza kwasu peptydowego zawierającego C-końcową resztę cysteiny wymaga szczególnej uwagi, ponieważ rozległa epimeryzacja⁴ i tworzenie β-piperydynyloalaniny⁵ może wystąpić podczas wydłużania łańcucha. Te reakcje uboczne są najbardziej problematyczne, gdy reszta cysteinowa jest zakotwiczona w żywicy typu Wanga. Na szczęście, zastosowanie żywic typu tritylowego⁶ takich jak żywica 2-chlorotritylowa, NovaSyn TGT, NovaPEG Trityl, wydaje się redukować te problemy do akceptowalnych poziomów i jest zdecydowanie zalecane do syntezy kwasów peptydowych zawierających C-końcową cysteinę.

Synteza peptydów cysteinylowych

Cys(Trt), Cys(Thp) i Cys(Dpm)

Do syntezy peptydów zawierających wolne grupy sulfhydrylowe najbardziej opłacalnym podejściem jest zastosowanie Fmoc-Cys(Trt)-OH. Ze względu na wysoką stabilność kationu tritylowego i silnie nukleofilowy charakter grupy tiolowej, reakcja ta jest odwracalna, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na warunki rozszczepiania, aby zapewnić całkowitą deprotekcję. Problemy z niepełną deprotekcją reszt Cys(Trt) można zwykle przezwyciężyć stosując koktajle rozszczepiające zawierające TIS^7a. Odczynnik ten jest niezwykle skuteczny w wygaszaniu kationu tritylowego, przekształcając go nieodwracalnie w trifenylometan. Można go zastąpić trietylosilanem, chociaż należy zachować ostrożność w przypadku peptydów zawierających niezabezpieczony tryptofan, ponieważ wiadomo, że silany powodują redukcję indoli.

W przypadku peptydów zawierających wiele reszt Cys(Trt) najlepsze wyniki uzyskuje się, jeśli peptyd jest wytrącany bezpośrednio do eteru dietylowego z mieszaniny rozszczepiającej TFA. Dodanie 2,5% etanoditiolu do koktajlu rozszczepiającego pomaga zapewnić utrzymanie peptydu w stanie zredukowanym i minimalizuje produkty uboczne spowodowane alkilacją tej grupy tiolowej cysteiny. Niezbędne jest użycie wystarczającej ilości koktajlu rozszczepiającego do ilości rozszczepianego peptydu. Zwykle wystarcza 30 ml na 0,5 mmola. (Jeśli jednak peptyd zawiera wiele reszt Cys i wiele t-butylowych grup ochronnych, stężenie EDT lub objętość koktajlu należy zwiększyć, aby zapewnić skuteczne oczyszczanie.

Ostatnio, Fmoc-Cys(Thp)-OH został wprowadzony jako alternatywa dla Fmoc-Cys(Trt)-OH, gdzie grupa sulfhydrylowa jest chroniona przez kwasową grupę tetrahydropiranylową (Thp)^7b. Wykazano, że zastosowanie Fmoc-Cys(Thp)-OH daje lepsze wyniki niż odpowiednie pochodne S-Trt, S-Dpm, S-Acm i S-StBu. Znacznie niższą racemizację i tworzenie -piperydynyloalaniny zaobserwowano dla C-końcowych reszt cysteinowych przyłączonych do żywic Wanga podczas przedłużonej obróbki piperydyną. Racemizacja podczas sprzęgania DIPCDI/Oxyma Pure Fmoc-Cys(Thp)-OH wynosiła tylko 0,74% w porównaniu z Fmoc-Cys(Trt)-OH (3,3%) i Fmoc-Cys(Dpm)-OH (6,8%). Całkowite usunięcie grupy Thp uzyskano przez traktowanie TFA / wodą / TIS 95: 2,5: 2,5 w ciągu 2 godzin. Grupa Thp jest jednak stabilna do 1% TFA w DCM, ułatwiając syntezę chronionych fragmentów peptydowych na żywicach labilnych nadkwasowo, takich jak żywice 2-chlorotrytylowe lub HMPB.Wstępne dowody sugerują, że peptydy S-Thp mają zwiększoną rozpuszczalność w porównaniu do tych chronionych Trt.

Fmoc-Cys(Dpm)-OH jest cenną alternatywą dla Fmoc-Cys(Trt)-OH do wprowadzania reszt Cys podczas Fmoc SPPS^7c. Regioselektywna synteza cyklicznych peptydów zawierających dwa mostki disulfidowe może być łatwo osiągnięta przy użyciu kombinacji sulfhydrylowych grup zabezpieczających Dpm i Mmt. Zabezpieczenie S-Dpm jest stabilne do 1 - 3% TFA, w przeciwieństwie do S-Trt, który jest powoli rozszczepiany, ale jest usuwany z 95% TFA. Właściwości te umożliwiają usuwanie grup S-Mmt za pomocą rozcieńczonego TFA na fazie stałej bez utraty grup S-Dpm. Wolne sulfhydryle można następnie utlenić, tworząc pierwszy mostek dwusiarczkowy. Późniejsze traktowanie koktajlem TFA/DMSO/anizol oddziela peptyd od żywicy, usuwa grupy S-Dpm i powoduje utworzenie drugiego mostka disulfidowego w jednym etapie.

Cys(Acm) i Cys(tBu)

Ochrona Acm i tBu może być również stosowana do przygotowania peptydu cysteinylowego. Jednak to podejście nie jest już w powszechnym użyciu.

Grupy Acm i t-butylowe są stabilne w warunkach wymaganych do usunięcia wszystkich innych grup zabezpieczających łańcuchy boczne. Dlatego pośrednie oczyszczanie peptydu jest możliwe przed rozszczepieniem tych grup chroniących cysteinę. Usunięcie tych grup ochronnych można osiągnąć przez traktowanie octanem rtęci (II) lub trifluoro-metanosulfonianem srebra. W tym drugim przypadku, traktowanie soli srebra peptydu cysteinylowego z aq. HCl-DMSO prowadzi do bezpośredniego tworzenia wiązań disiarczkowych⁸.

UWAGA: Sole rtęci i srebra są toksyczne i żrące; należy zachować szczególną ostrożność podczas używania tych odczynników.  Właściwa ochrona oczu, fartuch laboratoryjny i rękawice są obowiązkowe.  Przestrzegać lokalnych, stanowych/prowincjonalnych i federalnych przepisów bezpieczeństwa.

Metoda 1: Deprotekcja peptydów chronionych Acm za pomocą Hg(II)⁹

Dla wygody reakcje te można przeprowadzić w probówce wirówkowej.

1. Rozpuścić peptyd (Acm) w 10% aq. AcOH (5-10 mg/ml) i bardzo ostrożnie dostosuj pH roztworu do 4,0 za pomocą lodowatego AcOH.
2. Dodaj octan rtęci (II) (10 eq./Acm) i ponownie dostosuj pH do 4,0 za pomocą AcOH lub aq. NH₃. Delikatnie wymieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej pod kocem N₂.
3. Dodaj β-merkaptoetanol (20 eq./Acm) i pozostaw mieszaninę na 5 godzin.
4. Usuń osad przez odwirowanie i odsól supernatant za pomocą HPLC.

Metoda 2: Deprotekcja peptydów zabezpieczonych t-butylem za pomocą Hg(II)¹⁰

1. Rozpuścić peptyd (tBu) w lodowatym TFA (5-10 mg/ml).
2. Do powstałego roztworu dodać octan rtęci (II) (10 eq./tBu) i delikatnie mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 3 godziny pod kocem N₂.
3. Usuń TFA przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej i ponownie rozpuść pozostałość w 10% wodnym kwasie octowym.
4. Dodaj β-merkaptoetanol (20 eq./tBu) i pozostaw mieszaninę na 5 godzin.
5. Usuń osad przez odwirowanie i odsól supernatant za pomocą HPLC.

Metoda 3: Usuwanie grupy Acm za pomocą Ag(I)¹¹

1. Rozpuścić peptyd (Acm) w TFA/anizol (99:1) (1 mg/ml).
2. Do powstałego roztworu dodać trifluorometanosulfonian srebra (100 eq./Acm), a następnie mieszać w temperaturze 4°C przez 2 godziny.
3. Wytrącić sól srebrową peptydu za pomocą eteru i wyizolować przez odwirowanie.
4. Peptyd poddać działaniu ditiotreitolu (DTT) (40 eq./Acm) w 1 M kwasie octowym w temperaturze 25 °C przez 3 godziny. Odwirować i odsolić supernatant za pomocą HPLC.
5. Peptyd poddać działaniu aq. 1M HCl/DMSO (1:1) przez noc w temperaturze pokojowej. Usunąć AgCl przez filtrację i wyizolować produkt za pomocą HPLC.

Cys(t-butylthio) i Cys(STmp)

Insercja reszt Cys(tButhio)¹² lub Cys(STmp)¹³do sekwencji pozwala na selektywną deprotekcję grupy tiolowej na fazie stałej, umożliwiając modyfikację reszt Cys lub tworzenie mostków disiarczkowych na żywicy.

Grupa t-butylotio jest stabilna wobec TFA, pod warunkiem, że tiole nie są używane jako zmiatacze w reakcji rozszczepiania. Jest ona usuwana przez redukcję tiolami¹² lub trialkilofosfinami^14,15. Ostatnio Góngora-Benítez, et al.¹⁶ wykazali skuteczność 20% β-merkaptoetanolu, 0.1 M NMM w DMF do usuwania tbutylotio na fazie stałej, gdzie sam β-merkaptoetanol lub fosfiny okazały się nieskuteczne.

Jednak w praktyce usunięcie grupy tButhio na podłożu stałym często okazuje się niezwykle trudne. Z tego powodu Albericio niedawno wprowadził grupę STmp¹³. Grupa STmp wydaje się być niezwykle łatwa do usunięcia za pomocą łagodnej tiolizy, ponieważ Albericio zgłosił usunięcie czterech grup STmp z fazy stałej za pomocą zaledwie trzech 5-minutowych zabiegów 0.1 M N-metylomorfoliny (NMM) w DMF zawierającym 5% merkaptoetanolu.

Metoda 4: Usuwanie STmp z żywicy za pomocą tioli

1. Traktuj żywicę peptydylową 5% β-merkaptoetanolem, O.1 NMM w DMF przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przemyć żywicę DMF i powtórzyć obróbkę tiolami jeszcze dwa razy.

Cys(Mmt)

Deprotekcję reszt Cys(Mmt) na żywicy za pomocą 2% TFA w DCM można przeprowadzić w sposób wsadowy lub ciągły. W tym drugim przypadku reakcję można monitorować spektrofotometrycznie, śledząc uwalnianie kationu tritylowego przy 460 nm. W przypadku syntezy wsadowej do reakcji można dodać zmiatacz tritylu, taki jak TIS lub TES, w celu zwiększenia rozszczepienia. Reakcja powinna być przeprowadzona w szczelnie zamkniętym lejku ze szkła spiekanego, aby zapobiec parowaniu wysoce lotnego DCM, a reakcja filtracji powinna być przeprowadzona przez zastosowanie ciśnienia N₂ , a nie przez zastosowanie próżni.

Metoda 5: Usuwanie Mmt za pomocą 2% TFA w DCM.

Metoda wsadowa:

1. Suchą żywicę (1 g) zalać DCM w lejku ze szkła spiekanego (typu z kranikiem i korkiem).Usunąć nadmiar DCM.
2. Dodać 94:1:5 DCM/TFA/TIS (10 ml), zamknąć lejek i wstrząsać przez 2 minuty. Usunąć rozpuszczalnik stosując ciśnienie N₂.
3. Powtórzyć krok 2 pięć razy.
4. Umyć żywicę DCM i wysuszyć pod próżnią.

Metoda przepływowa:

1. Zalać żywicę (1 g) DCM i umieścić w kolumnie reakcyjnej.
2. Przepompować 1% TFA w DCM (2 mL/min) przez żywicę. Reakcję można śledzić mierząc absorbancję eluentu kolumny przy użyciu celi przepływowej 0,1 mm przy 460 nm^a.
3. Po zakończeniu reakcji, na co wskazuje powrót absorbancji do wartości wyjściowej, przepłukać kolumnę DCM.
   ^aJeśli peptyd zawiera inne grupy zabezpieczające oparte na tritylu, poziom nie powróci do wartości wyjściowej ze względu na powolne wymywanie grup Trt.

W praktyce całkowite usunięcie grupy Mmt może być trudne do osiągnięcia, szczególnie jeśli Mmt znajduje się w C-końcu peptydu. Przedłużone traktowanie 2% TFA może prowadzić do utraty grup ochronnych z łańcuchów bocznych aminokwasów.

Postępowanie z peptydami sulfhydrylowymi

Peptydy sulfhydrylowe są łatwo utleniane przez tlen atmosferyczny, dlatego powinny być liofilizowane natychmiast po odcięciu i przechowywane w stanie suchym pod argonem. Aby zminimalizować przedwczesne utlenianie, peptydy zawierające cysteinę powinny być przechowywane w buforach odgazowanych kwasem (0,1% TFA). Do analizy, bufory HPLC powinny być również odgazowane przez rozpylanie He. Peptydy zawierające wiele reszt Cys mogą wymagać redukcji po rozszczepieniu.

Tworzenie wiązań disiarczkowych przez utlenianie peptydów cysteinylowych

Losowe utlenianie peptydów sulfhydrylowych

Najprostszą metodą tworzenia jednego lub więcej mostków disulfidowych jest losowe utlenianie wolnego peptydu sulfhydrylowego. W tym przypadku peptydów zawierających więcej niż dwie reszty Cys, skład powstałych produktów może się różnić w zależności od tego, czy utlenianie odbywa się pod kontrolą termodynamiczną czy kinetyczną.

Kontrola termodynamiczna

Spośród tych technik, najłatwiejszą do przeprowadzenia procedurą jest utlenianie powietrzem, które daje termodynamicznie najbardziej stabilny produkt. Procedura ta polega po prostu na wystawieniu wodnego roztworu peptydu na działanie atmosfery w lotnym buforze, a następnie wyizolowaniu peptydu przez liofilizację. Małe monocykliczne peptydy mogą być łatwo przygotowane przez przeprowadzenie utleniania powietrzem natychmiast po rozszczepieniu TFA Cys(Trt) bez oczyszczania pośredniego peptydu sulfhydrylowego (metoda 6). Wadą tej procedury jest to, że reakcje mogą być czasami bardzo powolne. Wykazano również, że węgiel aktywowany skutecznie katalizuje ten proces¹⁷.

Metoda 6: Utlenianie powietrzem

1. Rozpuścić peptyd cysteinylowy w 0.1 M odgazowanego wodorowęglanu amonu (0,1-10 mg/ml).
2. Pozostawić mieszaninę otwartą do atmosfery aż do zakończenia reakcji. (Reakcję można monitorować za pomocą HPLC lub testu Ellmana).
3. Odizolować produkt przez liofilizację.

UWAGA: Liniowe stężenie peptydu może wymagać optymalizacji w celu zminimalizowania tworzenia się polimerów. Materiał polimerowy można usunąć przez odsolenie na kolumnie Sephadex G-15.

Metoda 7: Utlenianie glutationem

1. Rozpuścić peptyd cysteinylowy w 0.2 M odgazowanym buforze fosforanowym, pH 7,5 (0,1 - 10 mg/ml) zawierającym 1 mM EDTA, zredukowany (5 mM) i utleniony (0,5 mM) glutation.
2. Mieszać mieszaninę przez 1 do 2 dni, monitorując reakcję za pomocą HPLC.
3. Odizolować produkt przez liofilizację i odsolić za pomocą HPLC lub GPC.

Oksydacja mieszaniną cysteiny i cystyny lub zredukowanego i utlenionego glutationu jest przydatna do utleniania peptydów zawierających wiele mostków disiarczkowych. Obecność nadmiaru zredukowanego składnika prowadzi do powolnego przegrupowania pośrednich mostków peptydowych do najbardziej stabilnego termodynamicznie izomeru.

Kinetyczne utlenianie

Różne utleniacze zostały użyte do szybkiego tworzenia mostków dwusiarczkowych w celu wytworzenia kinetycznie najkorzystniejszego produktu. Należą do nich żelazicyjanek potasu¹⁸, jod¹⁹, DMSO^{20, 21}, N-chlorobursztynoimid (NCS) ²² i DPDS (2,2'-ditiopirydyna)²³.

Utlenianie jodem jest niezwykle szybkie i można je osiągnąć poprzez wkraplanie roztworu jodu do szybko mieszanego roztworu peptydu, aż roztwór będzie wyraźnie zabarwiony na żółto.

Utlenianie DMSO jest bardzo łagodne i działa przy pH od 3 do 8. Nie zgłoszono żadnych reakcji ubocznych obejmujących wrażliwe reszty (Met, Trp, Tyr).

NCS w DMF został użyty do utleniania sulfhydryli na fazie stałej, z zaledwie 2 równoważnikami wpływającymi na utlenianie w ciągu 15 minut²². Odczynnik ten może powodować utlenianie metioniny.

Metoda 8: Utlenianie jodem wolnych peptydów sulfhydrylowych

1. Rozpuścić peptyd cysteinylowy (0.1-10 mg/ml) w odgazowanym roztworze AcOH/woda lub MeOH/woda.
2. Dodawać kroplami 0,06 M roztwór jodu w MeOH szybko mieszając aż do uzyskania lekko żółtego zabarwienia roztworu. Ugasić nadmiar jodu 1M kwasem askorbinowym.
3. Odizolować produkt przez liofilizację i odsolić za pomocą HPLC lub GPC.

Metoda 9: Utlenianie DMSO

1. Rozpuścić peptyd cysteinylowy w AcOH. Rozcieńczyć do (0,1 - 10 mg/ml) wodą.
2. Dodać węglan amonu do pH 6, a następnie DMSO (10% objętościowo).
3. Mieszać mieszaninę przez 4 - 24 h monitorując reakcję za pomocą HPLC.
4. Oddzielić produkt za pomocą HPLC.

Metoda 10: Utlenianie DPDS²³

1. Rozpuścić peptyd cysteinylowy (0,1 - 10 mg/ml) w 0.1 M wodorowęglanu amonu.
2. Dodać 5 mM roztwór DPDS w MeOH (3 eq.).
3. Mieszać mieszaninę przez 30 - 120 min monitorując reakcję za pomocą HPLC.
4. Zakwasić za pomocą TFA i wyizolować produkt za pomocą HPLC.

Metoda 11: Utlenianie NCS na żywicy²²

1. Usuń grupy Cys-STmp lub Mtt z fazy stałej. Przemywać żywicę DMF.
2. Traktować żywicę peptydylową NCS (2 eq.) w DMF przez 15 minut w temperaturze rt.
3. Płukać żywicę DMF i DCM. Oddzielić peptyd od żywicy. Nie należy stosować zmiataczy tiolowych, ponieważ odczynniki te spowodują redukcję wiązania disiarczkowego. W większości przypadków EDT można zastąpić TIS.

.

Tworzenie wiązań disiarczkowych przez utlenianie chronionych peptydów cysteinylowych

Tworzenie wiązań disiarczkowych przez utlenianie jodem

Traktowanie peptydów zawierających reszty Cys(Acm)/Cys(Trt) jodem powoduje jednoczesne usunięcie sulfhydrylowych grup ochronnych i tworzenie wiązań disiarczkowych. Peptydy zawierające pojedynczą resztę Cys są przekształcane w symetryczny dimer, podczas gdy te zawierające wiele reszt są przekształcane w mieszaniny cyklicznych monomerów i polimerów, w zależności od rozpuszczalnika i stężenia. Szybkość reakcji jest bardzo zależna od rozpuszczalnika, co pozwala na pewien stopień selektywności między Cys(Trt) i Cys(Acm); w rozpuszczalnikach dipolarnych, takich jak aq. MeOH i aq. AcOH, zarówno Cys(Trt), jak i Cys(Acm) reagują szybko, podczas gdy w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak DCM i CHCl₃, utlenianie Cys(Acm) jest niezwykle powolne²⁴.

Najczęstszym zastosowaniem tej metody jest konwersja peptydów pozbawionych łańcucha bocznego, zawierających dwie reszty Cys(Acm) do cyklicznego monomeru z mostkiem disulfidowym; stosowanie ochrony tritylowej nie jest właściwe, ponieważ grupa ta zostanie usunięta podczas rozszczepiania TFA. Reakcja jest zwykle przeprowadzana w dużym rozcieńczeniu w mieszaninach aq. MeOH lub aq. AcOH, przy czym dokładny wybór rozpuszczalnika zależy od sekwencji. Reakcje są najszybsze w aq. MeOH; ale dla peptydów zawierających Tyr, His i Trp, aq. AcOH, ponieważ jego użycie ogranicza jodowanie tych wrażliwych reszt.

Dla utleniania jodem chronionych fragmentów peptydów w roztworze zaleca się, aby z dwóch reszt Cys, które mają być połączone mostkiem disiarczkowym, jedna była chroniona Acm, a druga Trt. Środek ten ogranicza tworzenie polimerów i pozwala na stosowanie niepolarnych mieszanin rozpuszczalników, takich jak TFE/CHCl₃ które sprzyjają rozpuszczaniu chronionego fragmentu. Zauważono, że utlenianie jodem peptydów zawierających resztę Cys z wolną funkcją N-aminową jest niezwykle powolne, prawdopodobnie w wyniku dodatniego ładunku na grupie aminowej hamującego tworzenie półproduktu sulfonowego.

Migracja Acm z cysteiny do łańcuchów bocznych reszt Gln^25a i Ser/Thr^25b została odnotowana podczas reakcji utleniania jodem i talem (III)

Metoda 12: Ogólna metoda utleniania jodem

1. Rozpuścić peptyd Cys-Acm (15 µmol) w AcOH (30 ml). Blanket pod N₂.
2. Dodaj 160 mM aq. HCl (5 mL). Dodać 20 mM I₂ w AcOH (45 mL).
3. Po 30-120 minutach energicznego mieszania (po zniknięciu materiału wyjściowego), ugasić jod przez dodanie 1 M aq. tiosiarczanu sodu lub kwasu askorbinowego kroplami, aż mieszanina stanie się bezbarwna i zatężyć przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem do około jednej trzeciej pierwotnej objętości. Wyizolować produkt metodą HPLC.

Alternatywnie²⁶:

3.  Po 30-120 minutach energicznego mieszania dodać 480 ml zimnego eteru dietylowego. Chłodzić na suchym lodzie przez 10 min. Wyizolować peptyd przez odwirowanie.

Nadmiar jodu można również usunąć przez ekstrakcję roztworu CCl₄ lub obróbkę węglem aktywnym lub proszkiem Zn.

Formowanie dwóch disulfidów w jednym naczyniu (na podstawie [27])

1. Rozpuścić peptyd 2xCys, 2xCys-Acm w AcOH (2 mg/ml) pod kocem N₂.
2. Dodaj około 1 eq. I₂ jako 0,5 M I₂ w MeOH kroplami aż do uzyskania trwałego brązowego koloru. Dodać kolejne 9 eq. jodu. Dodaj wodę, 20% objętości użytego AcOH i zamieszaj mieszaninę
3. Usuń nadmiar jodu jak opisano powyżej

Oksydacja trifluorooctanu talu

.Podobnie jak jod, Tl(CF₃CO₂)₃ przekształca peptydy zawierające wiele reszt Cys(Acm) w odpowiednie peptydy cystynowe z mostkami disulfidowymi [28]. W roztworze reakcja ta była zazwyczaj przeprowadzana w TFA, ponieważ jest to doskonały rozpuszczalnik zarówno dla wolnych, jak i chronionych peptydów. W przypadku bezpośredniego tworzenia wiązań dwusiarczkowych na fazie stałej, jako rozpuszczalnik zastosowano DMF, co pozwala na dobre pęcznienie żywicy bez przedwczesnego rozszczepiania łańcuchów peptydowych. Należy zauważyć, że Met i Trp muszą być chronione podczas obróbki Tl(CF₃CO₂)₃ aby uniknąć utleniania tych wrażliwych reszt; Met(O) i Trp(Mts) oraz Trp(Boc) zostały zastosowane odpowiednio w połączeniu z t-Boc²⁸ i Fmoc^29,30 strategiami.

UWAGA: Sole talu są wysoce toksyczne i żrące; należy zachować szczególną ostrożność podczas korzystania z tych odczynników.  Właściwa ochrona oczu, fartuch laboratoryjny i rękawice są obowiązkowe. Należy przestrzegać lokalnych, stanowych/prowincjonalnych i federalnych przepisów bezpieczeństwa.  Stosować w wydajnym dygestorium.

Metoda 13: Utlenianie w fazie roztworu za pomocą Tl(III)²⁸

1. Rozpuścić peptyd w TFA (1-10 mg/mL) z anizolem (10 µL/mg) i schłodzić w łaźni lodowej
2. Dodać Tl(CF₃CO₂)₃ (1.2 eq.) i pozostawić do przereagowania na 5-18 h.
3. Usuń TFA przez odparowanie w próżni i wytrąć peptyd za pomocą eteru. Odwirować i zdekantować eter, usuwając nadmiar odczynnika talowego.
4. Dodać świeży eter, wstrząsnąć probówką w celu rozproszenia peptydu i odwirować. Zdekantować eter i powtórzyć proces płukania trzy razy.

Metoda 14: Utlenianie w fazie stałej za pomocą Tl(III) ^{29, 30}

1. Zawiesić żywicę peptydylową w DMF/anizol (19:1) i dodać Tl(CF₃CO₂)₃ (1.2 eq. w stosunku do peptydu)
2. Pozostawić w temperaturze 0 °C na 80 min i przemyć żywicę DMF
3. Uwolnić peptyd z żywicy za pomocą TFA. Nie należy stosować zmiataczy tiolowych, ponieważ odczynniki te spowodują redukcję wiązania disiarczkowego. W większości przypadków EDT można zastąpić TIS.

Regioselektywne tworzenie wiązań disulfidowych

Synteza wielu peptydów zawierających disulfidy poprzez selektywne tworzenie mostków nie jest zadaniem, które należy podejmować lekkomyślnie. W syntezie peptydów zawierających wiele wiązań dwusiarczkowych najlepsze wyniki często uzyskuje się przez losowe utlenianie, ponieważ pożądany biologicznie aktywny izomer jest generalnie najbardziej stabilny termodynamicznie. Metody, które działają dla jednego peptydu, niekoniecznie działają dla innego. Czasami dwa mostki można utworzyć bez problemów, ale utworzenie trzeciego może okazać się trudne. Co więcej, kolejność tworzenia mostków jest często kluczowa. Selektywne utworzenie pierwszego mostu może stanowić szablon dla prawidłowego tworzenia innych mostów przez losowe utlenianie.

Do selektywnego tworzenia dwóch wiązań disulfidowych można zastosować kombinacje ochrony Trt i Acm lub STmp i Acm: pierwsze wiązanie disulfidowe powstaje po selektywnym usunięciu ochrony Trt lub STmp; generowanie drugiego wiązania disulfidowego jest następnie przeprowadzane w jednym etapie poprzez traktowanie peptydu chronionego Acm jodem lub trifluorooctanem talu. Alternatywnie, w przypadku Trt i Acm, można przeprowadzić reakcję jednopotową w roztworze, w której pierwszy disulfid powstaje w wyniku szybkiego utleniania peptydu disulfhydrylowego stechiometryczną ilością jodu, a następnie dodania nadmiaru jodu i wody w celu utlenienia tioli chronionych Acm (metoda 12).

Połączenie STmp i Mmt ułatwia selektywne tworzenie dwóch mostków na fazie stałej²². Grupy STmp są usuwane przez traktowanie merkaptoentanolem (metoda 4), a pierwszy mostek jest tworzony przez utlenianie NCS (metoda 11). Usunięcie Mmt za pomocą 2% TFA w DCM (metoda 5), a następnie ponowne utlenienie za pomocą NCS dostarcza drugiego mostka.

Tabela 2 Kombinacje grup ochronnych do selektywnej syntezy wielu wiązań dwusiarczkowych.

Pierwszy	Drugi	Trzeci	Komentarze
Trt	Acm		1: mostek przez utlenianie powietrzem lub stechiometryczne utlenianie I2. 2: przez nadmiarowe utlenianie I2.
tBu	MeBzl		Temperaturowo kontrolowane utlenianie z DMSO/TFA
STmp	Mmt		Tworzenie na żywicy obu mostków z utlenianiem NCS
Mmt	Dpm		Tworzenie jednego mostka na żywicy. Drugi mostek utworzony w roztworze przez utlenianie powietrzem
STmp	Acm		1: Na żywicy z utlenianiem NCS. 2: z utlenianiem w fazie stałej lub w roztworze I2.
STmp	Mmt	Acm	1 & 2: Tworzenie obu mostków na żywicy z utlenianiem NCS. 3: Utlenianie I2 w roztworze.
STmp	Mmt	tBu	1 & 2: Tworzenie na żywicy obu mostków z utlenianiem NCS. 3: DMSO/TFA lub MeSiCl3/Ph2SO w roztworze
Trt	Acm	tBu	1: mostek przez utlenianie powietrzem lub stechiometryczne utlenianie I2. 2: utlenianie nadmiarem I2. 3: TFA/DMSO lub MeSiCl3/Ph2SO.
Trt	tBu	MeBzl	1: mostek przez utlenianie powietrzem lub stechiometryczne utlenianie I2. 2 & 3: przez kontrolowane temperaturowo utlenianie TFA/DMSO

Ochrona t--butylowa, w połączeniu z jednoetapowym rozszczepieniem i cyklizacją za pomocą MeSiCl₃/Ph₂SO, została wykorzystana do wprowadzenia trzeciego mostka disiarczkowego, prowadząc do selektywnej syntezy -konotoksyny i insuliny³¹. W podobny sposób, kombinacja ochrony cysteiny tBu i MeBzl została zastosowana w regioselektywnym tworzeniu dwóch wiązań disulfidowych -konotoksyny SI³². Pierwsze wiązanie dwusiarczkowe utworzono przez rozszczepienie grup tBu i jednoczesne utlenianie TFA/DMSO/anizolem w temperaturze pokojowej. Późniejsze podgrzanie do 70°C spowodowało rozszczepienie grup MeBzl i utworzenie drugiego mostka disiarczkowego. Inne przykłady zastosowania tego podejścia w syntezie peptydów wielomostkowych można znaleźć w referencjach^33-36. Metody te mogą powodować utlenianie reszt Met i Trp.

Metoda 15: MeSiCl₃/Ph₂SO utlenianie³¹

1. Rozpuścić peptyd Cys-tBu w TFA (1 - 10 mg/ml)
2. Dodać Ph₂SO (10 eq.), CH₃SiCl₃ (100-250 eq.) i anizol (100 eq.)
3. Pozwolić reakcji przebiegać przez 10-30 min w 25 °C
4. Zgasić reakcję za pomocą NH₄F (300 eq.) i wytrącić peptyd przez dodanie dużej objętości zimnego eteru dietylowego i wyizolować. przez wirowanie

Metoda 16: Utlenianie TFA/DMSO³²

1. Rozpuścić peptyd w TFA/DMSO/anizol (97.9/2/0.1) (2 mg/ml)
2. Mieszać w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Dodać dodatkową porcję TFA/DMSO/anizol (40 mikroL/mg peptydu)
3. Podgrzewać w 70 °C przez 3 h. Wytrącić peptyd za pomocą eteru dietylowego i wyizolować przez odwirowanie.

Symetryczne disulfidy

S peptydy chronione Npys szybko reagują z tiolami w szerokim zakresie pH, tworząc mieszane disulfidy³⁷, dzięki czemu ta grupa ochronna jest szczególnie przydatna do przygotowania koniugatów peptyd-białko lub peptydów o dwóch różnych łańcuchach połączonych mostkiem disiarczkowym^38-41. Jednakże, ze względu na niestabilność grupy Npys do piperydyny podczas stosowania chemii Fmoc, reszta Cys(Npys) jest zwykle wprowadzana na N-końcu peptydu przy użyciu Boc-Cys(Npys)-OH.Alternatywnie stwierdzono, że grupa Npys może być dodana postsyntetycznie do dowolnej reszty Cys chronionej Trt przez dodanie 5 równoważników 2,2'-ditio-bis-(5-nitropirydyny) do standardowego TFA/TIS/woda (95:2.5:2.5)⁴².

Bezpośrednia konwersja Cys(tBu) do Cys(Pys) w obecności Cys(Acm) i mostka disiarczkowego została osiągnięta poprzez traktowanie DPDS/tioanizolem/TFA/TFMSA⁴³. Metoda ta została wykorzystana do dostarczenia aktywowanego łańcucha relaksiny A, kluczowego półproduktu do syntezy insulinopodobnego hormonu relaksiny⁴³.

Metoda 17: konwersja tBu do Pys⁴³

1. Rozpuścić peptyd Cys-tBu i DPDS (4 eq.) w TFA i tioanizolu (9:1 v/v) (50 mg/ml).
2. Mieszaninę schłodzono na lodzie, po czym dodano podobną objętość TFMSA w TFA (1:4 v/v) i kontynuowano reakcję przez 45 minut w temperaturze 0°C.
3. Peptyd Cys(Pys) wytrącano zimnym eterem dietylowym i izolowano przez odwirowanie. Przemyć osad 4 razy świeżym eterem w celu usunięcia nadmiaru DPDS.

Redukcja wiązań dwusiarczkowych

Redukcja za pomocą DTT

Od czasu wprowadzenia przez W.W. Cleland⁴⁴, DTT (kod produktu 233153-M) stał się standardowym odczynnikiem do redukcji peptydów cystinylowych. Ma słaby zapach, jest wysoce rozpuszczalny w wodzie i redukuje ilościowo disulfidy w środowisku wodnym przy pH 8.

Metoda 18: Redukcja za pomocą DTT

1. Rozpuścić peptyd w 0.1 M wodorowęglanu amonu (1-3 mg/ml).
2. Dodaj DTT (5-krotny nadmiar w stosunku do grup tiolowych).
3. Zblanszować mieszaninę N₂ i odstawić na 6 godzin.
4. Zakwasić mieszaninę AcOH i liofilizować.
5. Usuń DTT przez filtrację żelową.

Redukcja za pomocą TCEP

TCEP jest rozpuszczalną w wodzie fosfiną, która redukuje disulfidy w szerokim zakresie pH (1,5 -9,0)⁴⁵. W przeciwieństwie do środków redukujących opartych na tiolach, TCEP nie jest wrażliwy na tlen, więc nie są konieczne żadne specjalne środki ostrożności, aby wykluczyć powietrze. Reakcja jest nieodwracalna i kontrolowana kinetycznie, w przeciwieństwie do reakcji z DTT, która jest kontrolowana termodynamicznie⁴². Zastosowanie TCEP jest idealne do redukcji peptydów, które nie są rozpuszczalne przy pH 8 wymaganym do redukcji za pomocą DTT. Należy zauważyć, że przedłużony kontakt peptydu z nadmiarem TCEP może powodować odsiarczanie reszt cysteinowych.

Metoda 19: Redukcja za pomocą TCEP

1. Rozpuścić peptyd w dowolnej odpowiedniej mieszaninie rozpuszczalników wodno-organicznych (1-3 mg/ml, pH ).
2. Dodaj TCEP (5-krotny nadmiar w stosunku do disulfidu).
3. Delikatnie mieszaj roztwór przez 1 godzinę.
4. Oczyść zredukowany peptyd za pomocą HPLC lub filtracji żelowej.

.

Test Ellmana

5,5'-kwas ditiobis(2-nitrobenzoesowy) (DTNB) reaguje ilościowo z alifatycznymi grupami sulfhydrylowymi, generując żółty anion. Reakcja ta może być wykorzystana do śledzenia postępu reakcji utleniania w powietrzu. Próbki z mieszaniny reakcyjnej pobiera się w odpowiednich odstępach czasu i bada zawartość tiolu^{46, 47}.

Metoda 20: Test Ellmana

1. Rozpuścić DTNB (40 mg) w 0.1 M buforze fosforanu sodu, pH 8 (10 ml).
2. Pobierz próbkę z mieszaniny reakcyjnej i rozcieńcz buforem, aby uzyskać 3 ml roztworu zawierającego 0,1-0,2 µmola peptydu. Dodać odczynnik DTNB (0,1 ml) do roztworu peptydu i pozostawić mieszaninę na 15 minut. Zmierzyć absorbancję przy 410 nm przy użyciu 1 cm kuwety.
3. Przygotować roztwór odniesienia dodając odczynnik DTNB (0,1 mL) do buforu (3 mL) i zmierzyć absorbancję.
4. Obliczyć stężenie grup sulfhydrylowych za pomocą następującego równania; [SH] = [A410(próbka)-A410(odniesienie)]/13650.

.

Referencje

Referencje

1. Albericio F. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford: University Press.

2. Shabanpoor F. 2013. Peptide Synthesis & Applications Methods in Molecular Biology. 1047 , 81. Human Press.

3. Akcam M, Craik D. 2013. Peptide Synthesis & Applications Methods in Molecular Biology. 1047(89):

4. Kaiser T, Nicholson G, Kohlbau H, Voelter W. 1996. Racemization studies of Fmoc-Cys(Trt)-OH during stepwise Fmoc-Solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 37(8):1187-1190. https://doi.org/10.1016/0040-4039(95)02406-9

5. Han Y, Albericio F, Barany G. 1997. Occurrence and Minimization of Cysteine Racemization during Stepwise Solid-Phase Peptide Synthesis1,2. J. Org. Chem.. 62(13):4307-4312. https://doi.org/10.1021/jo9622744

6. Lukszo J, Patterson D, Albericio F, Kates SA. 1996. 3-(1-Piperidinyl)alanine formation during the preparation ofC-terminal cysteine peptides with the Fmoc/t-Bu strategy. Lett Pept Sci. 3(3):157-166. https://doi.org/10.1007/bf00132978

7. Giralt E, Andreu D, Atherton E. 1990. Peptides. Proc. 21st European Peptide Symposium; Leiden Escom: p. 243.

8. FUJIWARA Y, AKAJI K, KISO Y. 1994. Racemization-Free Synthesis of C-Terminal Cysteine-Peptide Using 2-Chlorotrityl Resin.. Chem. Pharm. Bull.. 42(3):724-726. https://doi.org/10.1248/cpb.42.724

9. Pearson D, Blanchette M, Guindon C. 1989. Tetrahedron Letters. 30,21. Great Britain: Pergamon Press plc.

10. Ramos-Tomillero I, Rodríguez H, Albericio F. 2015. Tetrahydropyranyl, a Nonaromatic Acid-Labile Cys Protecting Group for Fmoc Peptide Chemistry. Org. Lett.. 17(7):1680-1683. https://doi.org/10.1021/acs.orglett.5b00444

11. Góngora-Benítez M, Mendive-Tapia L, Ramos-Tomillero I, Breman AC, Tulla-Puche J, Albericio F. 2012. Acid-Labile Cys-Protecting Groups for the Fmoc/tBu Strategy: Filling the Gap. Org. Lett.. 14(21):5472-5475. https://doi.org/10.1021/ol302550p

12. TAMAMURA H, OTAKA A, NAKAMURA J, OKUBO K, KOIDE T, IKEDA K, IBLKA T, FUJII N. Disulfide bond-forming reaction using a dimethyl sulfoxide/aqueous HCl system and its application to regioselective two disulfide bond formation. 45(4):312-319. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1995.tb01043.x

13. Veber D, Milkowski J, Varga S, Denkewalter R, Hirschmann R. 1972. Acetamidomethyl. A Novel Thiol Protecting Group for Cysteine. J. Am. Chem. Soc.. 94(15):5456-5461. https://doi.org/10.1021/ja00770a600

14. NISHIMURA O, KITADA C, FUJINO M. 1978. New method for removing the S-p-methoxybenzyl and S-t-butyl groups of cysteine residues with mercuric trifluoroacetate.. Chem. Pharm. Bull.. 26(5):1576-1585. https://doi.org/10.1248/cpb.26.1576

15. Albericio F. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford University Press.

16. Postma TM, Giraud M, Albericio F. 2012. Trimethoxyphenylthio as a Highly Labile Replacement fortert-Butylthio Cysteine Protection in Fmoc Solid Phase Synthesis. Org. Lett.. 14(21):5468-5471. https://doi.org/10.1021/ol3025499

17. WEBER U, HARTTER P. 1970. S-Alkylmercapto-Gruppen zum Schutz der SH-Funktion des Cysteins, I. Synthese und Stabilität einigerS-(Alkylmercapto)cysteine. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 351(2):1384-1388. https://doi.org/10.1515/bchm2.1970.351.2.1384

18. Rüegg UT, Gattner H. 1975. Reduction of S-Sulpho Groups by Tributylphosphine: An Improved IVIethod for the Recombination of Insulin Chains. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 356(2):1527-1534. https://doi.org/10.1515/bchm2.1975.356.2.1527

19. BEEKMAN NJ, SCHAAPER WM, TESSER GI, DALSGAARD K, KAMSTRUP S, LANGEVELD JP, BOSHUIZEN RS, MELOEN RH. Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity. 50(5):357-364. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1997.tb01195.x

20. Góngora-Benítez M, Tulla-Puche J, Paradís-Bas M, Werbitzky O, Giraud M, Albericio F. 2011. Optimized Fmoc solid-phase synthesis of the cysteine-rich peptide linaclotide. Biopolymers. 96(1):69-80. https://doi.org/10.1002/bip.21480

21. 1998. Correspondence. Journal of Clinical Epidemiology. 51(4):365. https://doi.org/10.1016/s0895-4356(97)00299-0

22. McCurdy S. 1989. The investigation of Fmoc-cysteine derivatives in solid phase peptide synthesis. . Pept Res. . 2(1):147-152.

23. POHLS M, AMBROSIUS D, GRÖTZINGER J, KRETZSCHMAR T, SAUNDERS D, WOLLMER A, BRANDENBURG D, BITTER-SUERMANN D, HÖCKER H. Cyclic disulfide analogues of the complement component C3a Synthesis and conformational investigations. 41(4):362-375. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00452.x

24. Otaka A, Koide T, Shide A, Fujii N. 1991. Application of dimethylsulphoxide(DMSO) / trifluoroacetic acid(TFA) oxidation to the synthesis of cystine-containing peptide. Tetrahedron Letters. 32(9):1223-1226. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)92050-1

25. Tam JP, Wu CR, Liu W, Zhang JW. 1991. Disulfide bond formation in peptides by dimethyl sulfoxide. Scope and applications. J. Am. Chem. Soc.. 113(17):6657-6662. https://doi.org/10.1021/ja00017a044

26. Postma TM, Albericio F. 2013. N-Chlorosuccinimide, an Efficient Reagent for On-Resin Disulfide Formation in Solid-Phase Peptide Synthesis. Org. Lett.. 15(3):616-619. https://doi.org/10.1021/ol303428d

27. Maruyama K, Nagasawa H, Suzuki A. 1999. 2,2?-Bispyridyl disulfide rapidly induces intramolecular disulfide bonds in peptides. Peptides. 20(7):881-884. https://doi.org/10.1016/s0196-9781(99)00076-5

28. Kamber B, Hartmann A, Eisler K, Riniker B, Rink H, Sieber P, Rittel W. 1980. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation ofS-Trityl-cysteine andS-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helv. Chim. Acta. 63(4):899-915. https://doi.org/10.1002/hlca.19800630418

29. LAMTHANH H, ROUMESTAND C, DEPRUN C, MÉNEZ A. Side reaction during the deprotection of (S-acetamidomethyl)cysteine in a peptide with a high serine and threonine content. 41(1):85-95. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00118.x

30. Zhang S, Lin F, Hossain MA, Shabanpoor F, Tregear GW, Wade JD. 2008. Simultaneous Post-cysteine(S-Acm) Group Removal Quenching of Iodine and Isolation of Peptide by One Step Ether Precipitation. Int J Pept Res Ther. 14(4):301-305. https://doi.org/10.1007/s10989-008-9148-x

31. NA. NA.

32. FUJII N, OTAKA A, FUNAKOSHI S, BESSHO K, WATANABE T, AKAJI K, YAJIMA H. 1987. Studies on peptides. CLI. Syntheses of cystine-peptides by oxidation of s-protected cysteine-peptides with thallium(III) trifluoroacetate.. Chem. Pharm. Bull.. 35(6):2339-2347. https://doi.org/10.1248/cpb.35.2339

33. Munson MC, Barany G. 1993. Synthesis of .alpha.-conotoxin SI, a bicyclic tridecapeptide amide with two disulfide bridges: illustration of novel protection schemes and oxidation strategies. J. Am. Chem. Soc.. 115(22):10203-10210. https://doi.org/10.1021/ja00075a040

34. ALBERICIO F, HAMMER RP, GARCÍA-ECHEVERRÍA C, MOLINS MA, CHANG JL, MUNSON MC, PONS M, GIRALT E, BARANY G. Cyclization of disulfide-containing peptides in solid-phase synthesis?. 37(5):402-413. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb00755.x

35. Akaji K, Fujino K, Tatsumi T, Kiso Y. 1993. Total synthesis of human insulin by regioselective disulfide formation using the silyl chloride-sulfoxide method. J. Am. Chem. Soc.. 115(24):11384-11392. https://doi.org/10.1021/ja00077a043

36. Cuthbertson A, Indrevoll B. 2000. A method for the one-pot regioselective formation of the two disulfide bonds of ?-conotoxin SI. Tetrahedron Letters. 41(19):3661-3663. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)00437-8

37. Atherton E, Sheppard RC, Ward P. 1985. Peptide synthesis. Part 7. Solid-phase synthesis of conotoxin G1. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.2065. https://doi.org/10.1039/p19850002065

38. Yang Y, Sweeney WV, Schneider K, Chait BT, Tam JP. 1994. Two-step selective formation of three disulfide bridges in the synthesis of the C-terminal epidermal growth factor-like domain in human blood coagulation factor IX. Protein Sci.. 3(8):1267-1275. https://doi.org/10.1002/pro.5560030813

39. Akaji K, Fujino K, Tatsumi T, Kiso Y. 1993. Total synthesis of human insulin by regioselective disulfide formation using the silyl chloride-sulfoxide method. J. Am. Chem. Soc.. 115(24):11384-11392. https://doi.org/10.1021/ja00077a043

40. Zamborelli T. 2000. A comparison of folding techniques in the chemical synthesis of the epidermal growth factor?like domain in neu differentiation factor ?/?. Journal of Peptide Research. 55(5):359. https://doi.org/10.1034/j.1399-3011.2000.00672.x

41. Ihlenfeldt H. 1994. Peptides . Proc. 23rd European Peptide Symposium; Leiden ESCOM: p. 369.

42. Nielsen JS, Buczek P, Bulaj G. 2004. Cosolvent-assisted oxidative folding of a bicyclic?-conotoxin ImI. J. Peptide Sci.. 10(5):249-256. https://doi.org/10.1002/psc.531

43. Matsueda R, Aiba K. 1978. A STABLE PYRIDINESULFENYL HALIDE. Chem. Lett.. 7(9):951-952. https://doi.org/10.1246/cl.1978.951

44. DRIJFHOUT J, PERDIJK E, WEIJER W, BLOEMHOFF W. Controlled peptide-protein conjugation by means of 3-nitro-2-pyridinesulfenyl protection-activation. 32(3):161-166. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1988.tb00930.x

45. ALBERICIO F, ANDREU D, GIRALT E, NAVALPOTRO C, PEDROSO E, PONSATI B, RUE-GAYO M. Use of the Npys thiol protection in solid phase peptide synthesis Application to direct peptide-protein conjugation through cysteine residues. 34(2):124-128. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1989.tb01500.x

46. PLOUX O, CHASSAING G, MARQUET A. Cyclization of peptides on a solid support. Application to cyclic analogs of Substance P. 29(2):162-169. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1987.tb02242.x

47. SIMMONDS RG, TUPPER DE, HARRIS JR. Synthesis of disulfide-bridged fragments of ?-conotoxins GVIA and MVIIA. 43(4):363-366. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1994.tb00532.x

48. Ghosh AK, Fan E. 2000. A novel method for sequence independent incorporation of activated/protected cysteine in Fmoc solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 41(2):165-168. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(99)02045-6

49. Bathgate RAD, Lin F, Hanson NF, Otvos, L, Guidolin A, Giannakis C, Bastiras S, Layfield SL, Ferraro T, Ma S, et al. 2006. Relaxin-3:  Improved Synthesis Strategy and Demonstration of Its High-Affinity Interaction with the Relaxin Receptor LGR7 BothIn VitroandIn Vivo?. Biochemistry. 45(3):1043-1053. https://doi.org/10.1021/bi052233e

50. Cleland WW. 1964. Dithiothreitol, a New Protective Reagent for SH Groups*. Biochemistry. 3(4):480-482. https://doi.org/10.1021/bi00892a002

51. Burns JA, Butler JC, Moran J, Whitesides GM. 1991. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. J. Org. Chem.. 56(8):2648-2650. https://doi.org/10.1021/jo00008a014

52. Ellman GL. 1959. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics. 82(1):70-77. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6

53. Ellman GL, Courtney K, Andres V, Featherstone RM. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7(2):88-95. https://doi.org/10.1016/0006-2952(61)90145-9