Protokół rozszczepiania żywicy Boc

Najpopularniejszym odczynnikiem do rozszczepiania peptydów z żywic na bazie Boc jest bezwodny HF. Ze wszystkich procedur rozszczepiania HF wydaje się być najbardziej uniwersalną i najmniej szkodliwą dla szerokiej gamy peptydów syntetyzowanych na żywicach na bazie Boc. Główną wadą tej procedury pozostaje jej wysoce toksyczny i reaktywny charakter, który wymaga użycia drogich, odpornych na HF wyciągów i aparatury do rozszczepiania.

Inne silne kwasy, takie jak TFMSA i trifluorometanosulfonian trimetylosililu (TMSOTf) mogą być stosowane jako alternatywa dla HF do rozszczepiania z żywic MBHA. Chociaż mniej reaktywne niż HF, należy jednak zauważyć, że zarówno TFMSA, jak i TMSOTf są niezwykle żrące i należy zachować szczególną ostrożność podczas ich stosowania.

Oprócz rozszczepiania kwasem, kilka rodzajów żywic, takich jak oksym, można rozszczepiać różnymi metodami, aby uzyskać hydrazydy peptydowe i analogi chronionych fragmentów. Na potrzeby tej dyskusji skoncentrujemy się na najczęściej stosowanych obecnie metodach rozszczepiania kwasem. Szczegółowe informacje na temat rozszczepiania i deprotekcji specyficznych dla danego typu żywicy można znaleźć w literaturze cytowanej dla każdej żywicy.

Tabela 1. Pochodne aminokwasów kompatybilne z boc.

Kompatybilny z HF	Kompatybilny z TMSOTf.	Kompatybilny z TFMSA	Kompatybilny z HBr
Arg(NO2)	Asp(OcHp)	Arg(Mts)	Arg(Mts)
Asp(OBzl)	Asp(OBzl)	Asp(OBzl)	Asp(OBzl)
Asp(OcHx)	Arg(Mts)	Cys(Acm)1	Cys(Acm)1
Cys(Acm)1	Cys(Acm)1	Cys(pMeOBzl)	Cys(pMeBzl)
Cys(pMeBzl)	Glu(OBzl)	Glu(OBzl)	Glu(OBzl)
Cys(pMeOBzl)	Glu(OcHp)	His(Bom)	His(Bom)
Glu(OBzl)	His(Bom)	His(Dnp)	His(Dnp)
Glu(OcHx)	Lys(2-Cl-Z)	His(Tos)	His(Tos)
His(Bom)	Met(O)3	His(Z)	His(Z)
His(Dnp)	Ser(Bzl)	Lys(2-Cl-Z)	Lys(2-Cl-Z)
His(Tos)	Thr(Bzl)	Met(O)	Met(O)
His(Z)	Tyr(2-Br-Z)	Ser(Bzl)	Ser(Bzl)
Lys(2-Cl-Z)	Tyr(Bzl)	Thr(Bzl)	Thr(Bzl)
Ser(Bzl)	Tyr(di-Cl-Bzl)	Trp(For)2	Trp(For)2
Thr(Bzl)	Trp(For)	Tyr(2-Br-Z)	Tyr(2-Br-Z)
Trp(For)2	Trp(Mts)
Tyr(2-Br-Z)

¹ Cys(Acm) jest rozszczepiany z cyklizacją przez jod lub bez cyklizacji przez octan rtęci (II).

² Trp(For) powinien być zdeprotonowany przy użyciu metody niskiego-wysokiego HF. Alternatywnie, powinien być traktowany 10% piperydyną w DMF (Method 2) przed traktowaniem silnym kwasem.

³ Met(O) nie jest ilościowo redukowany przez TMSOTf; preferowane są metody Low-High HF lub TFMSA.

Przygotowanie żywicy do rozszczepienia

Właściwe przygotowanie żywicy peptydylowej przed rozszczepieniem jest ważne dla zapobiegania reakcjom ubocznym i niepełnemu rozszczepieniu i deprotekcji peptydu. Wybór metody rozszczepiania i deprotekcji zależy nie tylko od zastosowanej żywicy, ale także od sekwencji i wyboru ochrony łańcucha bocznego aminokwasu. Przed rozpoczęciem syntezy należy upewnić się, że zastosowana żywica i zabezpieczenie łańcucha bocznego są zgodne z metodą rozszczepiania. Wszystkie żywice powinny być odpowiednio umyte i wysuszone przed rozszczepieniem.

Usunięcie grupy zabezpieczającej Dnp z His

Jeśli peptyd zawiera His(Dnp), histydyna musi zostać usunięta przed usunięciem N-końcowej grupy Boc¹. Szczegółowe informacje na temat usuwania grupy Dnp histydyny i alternatywnych pochodnych histydyny można znaleźć w Metodzie 1 poniżej.

Metoda 1: Usuwanie grup zabezpieczających Dnp

1. Zanurzyć żywicę w minimalnej objętości DMF.
2. Poddać działaniu 20-krotnego molowego nadmiaru tiofenolu przez 1-2 h w temperaturze rt (reakcję można pozostawić bez reakcji).
3. Przenieść żywicę do lejka ze szkła spiekanego i przemyć kolejno DMF, metanolem i eterem dietylowym przed traktowaniem ciekłym HF lub TFMSA.

Usunięcie N-końcowej grupy Boc

Przed rozszczepieniem HF N-końcowa grupa Boc musi zostać usunięta przy użyciu TFA. Zapobiega to nie tylko możliwej t-butylacji podatnych reszt podczas rozszczepiania HF, ale także usuwa wszelkie Boc-aminokwasy zatrzymane na żywicy przez wymianę jonową². Usunięcie N-końcowej grupy Boc nie jest wymagane do rozszczepienia TFMSA. Sprawdź instrukcję obsługi swojego syntezatora; wiele syntezatorów automatycznie programuje usunięcie N-końcowej grupy Boc jako ostatni etap syntezy.

Ręczne usunięcie N-końcowej grupy Boc można osiągnąć poprzez umieszczenie żywicy w kolbie okrągłodennej i płukanie 50% (v/v) TFA/DCM przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Po usunięciu N-końcowej grupy Boc żywicę peptydową można następnie przenieść do lejka ze szkła spiekanego i przemyć dwukrotnie (5 objętości) DCM, dwukrotnie MeOH i ostatnią parą przemyć DCM. Należy unikać nadmiernego zasysania powietrza, ponieważ wilgoć zawarta w powietrzu zostanie wchłonięta przez zimną żywicę i może być trudna do usunięcia. Wilgoć może być bardzo szkodliwa w rozszczepianiu HF.

Po przemyciu żywica peptydowa powinna być suszona pod wysoką próżnią przez 4 godziny, a najlepiej przez noc nad KOH lub P₂O₅. Jeśli używasz rozszczepienia TFMSA bez usuwania N-końcowej grupy Boc, użyj tych samych etapów mycia i suszenia jak powyżej.

Deformylacja żywic peptydowych zawierających Trp(For)-

Grupa formylowa jest stabilna wobec kwasowych odczynników rozszczepiających i może być usunięta przed rozszczepieniem przy użyciu standardowych protokołów HF (Metoda 2). Chociaż alkilacja niezabezpieczonego pierścienia indolowego tryptofanu przez jony t-butylowęglowe stanowi problem podczas rozszczepiania za pomocą HF, zmiatacze takie jak indol² zostały z powodzeniem wykorzystane do ochrony peptydów zawierających Trp przed alkilacją. Jednakże indol może również ulegać dimeryzacji katalizowanej kwasem z tryptofanem i nieodwracalnie modyfikować pierścień indolowy³.

Metoda 2: Deformylacja piperydyną żywic peptydowych zawierających Trp(For)

1. Umieść piperydynę: DMF 1:10 (v/v) w kolbie okrągłodennej i schłodzić w łaźni lodowej do 0°C.
2. Dodać żywicę peptydową (1 g na 10 ml) i mieszać przez 2 h utrzymując temperaturę 0°C.
3. Przefiltrować żywicę dwukrotnie przez DMF (5 objętości), dwukrotnie przez DCM i dwukrotnie przez MeOH.
4. Suszyć pod wysoką próżnią jak wyżej przez co najmniej 4 h przed rozszczepieniem przy użyciu HF.

Alternatywnie, grupa formylowa może być usunięta przez rozszczepienie tiolityczne przy użyciu protokołu "low-high" (HF⁴ lub TFMSA⁵) z DMS, p-tiokrezolem lub tiofenolem. Zgodnie z tym protokołem niskie warunki rozszczepiania usuwają większość grup benzylowych przed tiolitycznym rozszczepieniem Trp(For) w wysokich warunkach. Usunięcie t-butylowych jonów karbonu podczas niskiego rozszczepienia znacznie minimalizuje alkilację pierścienia indolowego tryptofanu podczas wysokiej procedury⁴.

Inna opcja, choć prawdopodobnie mniej pożądana, obejmuje usunięcie grupy formylowej po wysokim rozszczepieniu HF przy użyciu wodnej zasady, takiej jak 0,03 M hydroksyloamina.03 M hydroksyloaminy przy pH 9.0 przez dwie godziny⁶.

Rozszczepienie HF

Uwaga: Bezwodny HF jest niezwykle toksyczną, żrącą i lotną cieczą (temp. p.p. 19 °C). Wszystkie procedury wymagające HF muszą być wykonywane w aparaturze odpornej na HF w wyciągu wyposażonym w płuczkę. Nie należy używać aparatury szklanej, ponieważ HF rozpuści szkło w niezwykle szybkiej i egzotermicznej reakcji.

Prawidłowa ochrona oczu, osłona twarzy, gumowy fartuch i gumowe rękawice są obowiązkowe podczas używania HF. Nie należy ryzykować. Należy przestrzegać lokalnych, stanowych/prowincjonalnych i federalnych przepisów bezpieczeństwa i ochrony środowiska. Wdychanie HF może spowodować śmierć.

Doskonały opis aparatów HF i ich zastosowania można znaleźć w syntezie peptydów w fazie stałej autorstwa Stewart & Young². Zawsze należy postępować zgodnie z informacjami dostarczonymi przez producenta używanej aparatury do rozszczepiania HF.

Standardowe rozszczepianie HF

Rozszczepianie HF jest zwykle wykonywane w temperaturach 0-5 °C przez okres 30-60 minut. Peptydy zawierające Arg(Tos) mogą wymagać dłuższego czasu rozszczepiania. Problemy można napotkać, jeśli peptyd zawiera jedną lub kombinację problematycznych reszt, takich jak Trp, Met, Asp, Glu, Cys i Tyr.

Zarówno czas, jak i temperatura odgrywają kluczową rolę w minimalizowaniu możliwych reakcji ubocznych podczas rozszczepiania i deprotekcji. Żywice peptydowe zawierające Asp/Glu (OBzl) lub Asp/Glu (OcHx) powinny być rozszczepiane w temperaturze 5 °C lub niższej w celu zmniejszenia tworzenia aspartymidu⁷ i anizilacji Glu odpowiednio⁸. Obniżenie temperatury wpływa na szybkość usuwania grup zabezpieczających łańcuchy boczne. Rozszczepianie żywic peptydowych zawierających Arg(Tos), Cys(pMeBzl) i Lys(2-Cl-Z) w temperaturach niższych niż 5 °C może być bardzo powolne i niepraktyczne. Żywice peptydowe z Arg(Tos) mogą wymagać czasu rozszczepienia do 2 godzin w 5 °C. W przypadku stosowania His(Dnp) i/lub Trp(For) wymagana jest obróbka przed rozszczepieniem.

Rozszczepiacze odgrywają kluczową rolę w zmniejszaniu możliwości wystąpienia reakcji ubocznych. Anizol pozostaje jednym z najczęściej stosowanych zmiataczy do rozszczepiania HF i zapobiega alkilacji tryptofanu przez kationy t-butylowe i benzylowe. W połączeniu z DMS i p-tiokrezolem, anizol zapobiega alkilacji Met i Cys⁹. Należy unikać stosowania tioanizolu, jeśli peptyd zawiera tryptofan. Addukty kationu tioanizolu mogą alkilować azot pierścienia indolowego Trp.

Metoda 3: Standardowe rozszczepienie HF

0.Skala 2 mmole

1. Umieść żywicę peptydową, mieszadło pokryte teflonem i mieszaninę zmiataczy w naczyniu reakcyjnym. Dla peptydów zawierających Cys większość badaczy używa HF/anizol/DMS/p-tiokrezol (10:1:1:0.2). Dla innych peptydów niezawierających Cys stosuje się HF/DMS/anizol (10:1:1).
2. Zakręć korek naczynia reakcyjnego i schładzaj w łaźni metanolowej z suchym lodem przez co najmniej 5 minut przed przystąpieniem do rozszczepiania.
3. Dystyl 10 ml HF do kolby zgodnie z instrukcją producenta (utrzymując temperaturę między -5 °C a 0 °C). W przypadku peptydów zawierających Arg(Tos) reakcja będzie wymagała do 2 godzin.
4. Pod koniec czasu reakcji odparuj HF i DMS pod strumieniem N₂.
5. Ekstrahuj żywicę za pomocą TFA, aby usunąć peptyd z matrycy żywicy.
6. Usuń żywicę przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Przemyć żywicę dwukrotnie czystym TFA. Połączyć filtraty i dodać (kroplami) 8-10-krotną objętość zimnego eteru. Czasami konieczne jest odparowanie większości TFA w celu uzyskania dobrego wytrącenia surowego peptydu. Eter można schłodzić lodem, aby dodatkowo wspomóc wytrącanie.
7. Izoluj peptyd zgodnie z opisem w Metoda 8.

.

Nisko-wysoka procedura HF

Nisko-wysoka procedura Tam i in.⁴ wykorzystuje niskie stężenia HF w dużej ilości zmiatacza, takiego jak DMS (1:3 objętościowo). W niskich warunkach mechanizm rozszczepiania zmienia się ze zwykłego S_N1 (gdzie wytwarzane są jony węglowe i nitroniowe) na S_N2. Procedura ta zapobiega alkilacji tyrozyny przez kationy benzylowe i t-butylowe, tworzeniu peptydów sukcynoimidowych z sekwencji Asp-Gly i acylowaniu cząsteczek zmiatacza przez glutamylowe łańcuchy boczne. Przy niskich stężeniach HF i w obecności DMS, Met(O) zostanie zredukowany do Met.

Jeśli po niskiej procedurze nastąpi standardowe rozszczepienie HF, Arg(Tos) i Arg(NO₂) zostaną usunięte. Sama niska procedura może nie być wystarczająca do rozszczepienia peptydów z żywic BHA. Głównymi wadami tej procedury są dodatkowy czas wymagany do rozszczepienia, użycie dużych ilości DMS i tworzenie adduktów zmiataczy tiolowych, które mają bardzo silny i nieprzyjemny zapach.

Żywice Merrifield

Dla żywic opartych na Merrifield, Tam, et al.⁴ zaleca rozszczepianie przy użyciu HF/DMS/p-krezol, 25:65:10, v/v w 0 °C przez 2 godziny. Jeśli peptyd zawiera Arg(Tos) lub inne substancje funkcyjne stabilne na niskie HF, zalecają najpierw rozszczepienie za pomocą HF/DMS/p-krezol 25:65:10, v/v przez 2 godziny w 0 ° C, a następnie wysoką procedurę, która obejmuje odparowanie całego HF i DMS w próżni w 0 ° C, a następnie ponowne naładowanie naczynia bezwodnym HF i rozszczepienie przez 30-60 minut w 0 ° C do 10 ° C w zależności od sekwencji. Jeśli Trp(For) jest obecny w peptydzie, grupa formylowa może być usunięta pod niskim HF przez zastąpienie p-krezolu p-tiokrezolem lub tiofenolem⁴.

Żywice MBHA

Dla peptydów syntetyzowanych na żywicach MBHA Tam, et al.⁴ zaleca obróbkę w niskich warunkach przez 1-2 godziny w celu deprotekcji łańcuchów bocznych. Po deprotekcji należy odparować HF i DMS i przemyć żywicę DCM lub EtOAc w celu usunięcia soli sulfonowych, dimetylosulfotlenku i pochodnych tiolowych, a następnie odessać do sucha. Peptyd można następnie rozszczepić za pomocą HF / p-krezolu 9: 1 (v / v) przez 30-60 minut w temperaturze 0 ° C, co usunie wszystkie pozostałe grupy ochronne i oddzieli peptyd od żywicy.

Rozszczepienie TMSOTf

Uwaga: TMSOTf jest niezwykle żrącą i łatwopalną cieczą. Właściwa ochrona oczu, osłona twarzy, gumowy fartuch i gumowe rękawice są obowiązkowe. Należy przestrzegać lokalnych, stanowych/prowincjonalnych i federalnych przepisów bezpieczeństwa i ochrony środowiska. Zawsze używaj wydajnego wyciągu. Opary są szkodliwe w przypadku wdychania.

TMSOTf stanowi alternatywę dla rozszczepiania HF i TFMSA. Yajima i in.¹² donoszą, że rozszczepienie TMSOTf powoduje mniej reakcji ubocznych i daje produkt, który jest mniej higroskopijny niż produkty peptydowe z rozszczepienia TFMSA. Procedura ta rozszczepia większość grup ochronnych łańcucha bocznego występujących w syntezie Boc. Peptydy zawierające Cys(Bzl), Cys(Acm) i Arg(NO2) nie powinny być deprotekowane przy użyciu TMSOTf, ponieważ te grupy zabezpieczające łańcuchy boczne są stabilne dla TMSOTf.

Peptydy zawierające Arg(Tos) będą wymagały dłuższego czasu rozszczepiania. W przeciwieństwie do TFMSA, Met(O) nie zostanie ilościowo zredukowany do Met i dlatego konieczna jest alternatywna metoda redukcji Met(O) do Met¹³. Peptydy zawierające Trp(For) wymagają obecności EDT w koktajlu rozszczepiającym w celu pełnego usunięcia grupy formylowej.

Metoda 6: Rozszczepianie TMSOTf

1. Umieść 1 g wysuszonej żywicy w kolbie okrągłodennej zawierającej mieszadło.
2. Ochłodzić kolbę do temperatury 0°C za pomocą łaźni lodowej i dodać do niej schłodzoną mieszaninę rozszczepiającą (1,95 ml TMSOTf, 6,90 ml TFA, 1,2 ml m-krezolu). Utrzymywać temperaturę 0°C przez 2 godziny przy ciągłym mieszaniu, aby zapewnić całkowitą deprotekcję.
3. Usuń żywicę przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Przemyć żywicę dwukrotnie czystym TFA. Połączyć filtraty i dodać (kroplami) 8-10 krotną objętość zimnego eteru.
4. Izolować peptyd jak opisano w Metoda 8.

Dwuetapowa procedura deprotekcji/wydzielania twardych kwasów dla syntezy peptydów w fazie stałej obejmująca TMSBr/TFA, a następnie TMSOTf/TFA została opisana przez Nomizu, et al.¹⁴. Jego przydatność została wykazana przez porównanie z innymi metodami deprotekcji w syntezie dwóch różnych peptydów testowych. Zachęcamy czytelników do zapoznania się z tym artykułem w celu uzyskania dalszych szczegółów.

Rozszczepienie TFMSA

Uwaga: TFMSA jest niezwykle silnym kwasem; odpowiednia ochrona oczu, osłona twarzy, gumowy fartuch i gumowe rękawice są obowiązkowe. Należy przestrzegać lokalnych, stanowych/prowincjonalnych i federalnych przepisów bezpieczeństwa i ochrony środowiska. Zawsze używać w wydajnym wyciągu. Opary są szkodliwe w przypadku wdychania.

TFMSA jest alternatywą dla rozszczepiania HF. Główną zaletą tej procedury jest to, że można ją wykonać przy użyciu standardowego szkła laboratoryjnego. W przeciwieństwie do HF, TFMSA nie jest lotny i dlatego jest trudny do usunięcia przez odparowanie₂. Peptyd musi być wytrącony z roztworu przy użyciu suchego rozpuszczalnika, takiego jak eter etylowy.

Peptydy rozszczepione TFMSA są podatne na asocjację z solą i zmiataczem. Wytrącone peptydy⁹ powinny zostać zneutralizowane, a sole usunięte poprzez wymianę jonową lub przy użyciu kolumn Sephadex przed dalszym oczyszczaniem.

Podobnie jak w przypadku HF, TFMSA może być stosowany zarówno ze standardowym protokołem, jak i protokołem "low-high" w zależności od sekwencji. Należy pamiętać, że odczynnik ten nie deprotekcjonuje grup Arg(NO₂) lub Arg(Tos), jeśli są obecne¹⁰. His(Dnp) wymaga wstępnego rozszczepienia.

Standardowe rozszczepienie TFMSA

Żywice MBHA będą wymagały czasu rozszczepienia od 90 minut do dwóch godzin w temperaturze pokojowej (Metoda 4).

Metoda 4: Standardowe rozszczepianie TFMSA

Waga 250 mg

1. Umieść 250 mg wysuszonej żywicy w kolbie okrągłodennej z mieszadłem. Dodaj 750 µL tioanizolu/EDT (2:1).
2. Zamroź kolbę okrągłodenną w łaźni lodowej i dodaj 5 ml TFA i mieszaj przez 5-10 min.
3. Dodaj (powoli) 500 µL TFMSA kroplami energicznie mieszając, aby rozproszyć wytworzone ciepło.
4. Pozwolić na kontynuowanie reakcji w temperaturze rt przez żądany czas.
5. Usuń żywicę przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Przemyć żywicę dwukrotnie czystym TFA. Połączyć filtraty i dodać (kroplami) 8-10-krotną objętość zimnego eteru.
6. Izolować peptyd jak opisano w Metoda 8.

Grupy Asp(OcHx) i Cys(MeBzl) nie są skutecznie usuwane za pomocą tej procedury. Żywice peptydowe zawierające Trp(For) powinny być rozszczepiane przy użyciu procedury low-high z EDT (Metoda 5).

TFMSA low-high cleavage

Procedura low-high początkowo wykorzystuje niskie stężenie TFMSA w dużej objętości zmiatacza DMS. W niskich warunkach mechanizm rozszczepiania zmienia się z S_N1 (gdzie wytwarzane są jony węglowe i nitroniowe) na S_N2. Jeśli peptydy zawierają Met, do syntezy należy użyć pochodnej Met(O). W niskich warunkach w obecności DMS Met(O) zostanie zredukowany do Met¹¹. Dodanie EDT do koktajlu rozszczepiającego w wysokich warunkach spowoduje deprotekcję Trp(For) poprzez rozszczepienie tiolityczne⁵. EDT zminimalizuje również powstawanie dimerów poprzez mostki dwusiarczkowe, gdy peptyd zawiera reszty Cys.

W fazie niskiej protokołu rozszczepiania niskiego-wysokiego ważne jest utrzymanie niskich temperatur od 0 °C do 5 °C podczas całej reakcji.

Metoda 5: Nisko-wysokie rozszczepienie TFMSA

Niskie rozszczepienie

1. Umieść żywicę peptydową (250 mg) w kolbie okrągłodennej z mieszadłem i schłodź w łaźni lodowej do temperatury od 5 °C do 0 °C.
2. Dodaj 250 µL m-krezolu, 750 µL DMS i 1,25 ml TFA, dodaj kroplami 250 µL TFMSA do mieszaniny reakcyjnej mieszając w celu rozproszenia wytworzonego ciepła.
3. Dla peptydów zawierających Trp(For) dodaj 50 µL EDT do koktajlu rozszczepiającego.
4. Pozwolić mieszaninie reagować przez 3 godziny, utrzymując temperaturę pomiędzy 0°C a 5°C.
5. Przenieść zawartość kolby do średniego lejka ze szkła spiekanego i przemyć żywicę kilkoma objętościami Et₂O i odessać do sucha.
6. Suszyć żywicę pod wysoką próżnią przez co najmniej 4 godziny nad P₂O₅ lub KOH.

Wysokie rozszczepienie

1. Umieścić wysuszoną żywicę w kolbie okrągłodennej z mieszadłem i dodać 250 µL tioanizolu i 75 µL EDT i mieszać przez 5-10 min.
2. Ochłodzić do temperatury od 5°C do 0°C za pomocą łaźni lodowej i dodać 2,5 ml TFA. Mieszać 5-10 min, a następnie dodać kroplami 250 µL TFMSA mieszając w celu rozproszenia ciepła.
3. Wyjmij kolbę z łaźni lodowej i pozostaw do reakcji w temperaturze rt przez 30 min z żywicami PAM. Żywice MBHA wymagają 90-120 min do całkowitego rozszczepienia.
4. Usuń żywicę przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Przemyć żywicę dwukrotnie za pomocą TFA. Połączyć filtraty i dodać (kroplami) 8-10-krotną objętość zimnego eteru.
5. Izolować peptyd jak opisano w Metoda 8.

Rozszczepianie bromkiem wodoru

Uwaga: HBr w kwasach takich jak TFA, kwas piwalanowy, kwas izomasłowy, kwas izowalerianowy i kwas octowy są niezwykle silnymi kwasami. Właściwa ochrona oczu, osłona twarzy, gumowy fartuch i gumowe rękawice są obowiązkowe. Należy przestrzegać lokalnych, stanowych/prowincjonalnych i federalnych przepisów bezpieczeństwa i ochrony środowiska. Zawsze używaj wydajnego wyciągu. Opary są szkodliwe w przypadku wdychania.

Ta procedura¹⁵ jest stosowana do usuwania peptydów z żywicy MBHA. Zaletami tej metody jest użycie dostępnego w handlu 30% HBr w kwasie octowym (około 5 M), możliwość użycia standardowego szkła laboratoryjnego i możliwość łatwego zwiększenia skali. Mieszanina rozszczepiająca powinna zawierać pentametylobenzen, który przyspiesza rozszczepianie i kwasolityczne usuwanie grup ochronnych. Eksperymenty wykazały również, że Met(O) jest ilościowo redukowany do Met podczas procedury HBr, ale zamiast tioanizolu należy użyć dimetylosiarczku, aby zapobiec tworzeniu się peptydów S-metylometionylowych.

Standardowe rozszczepienie HBr/kwas octowy

Czas reakcji dla żywicy MBHA wynosi zwykle od 60 do 90 minut w temperaturze pokojowej. Grupy zabezpieczające Boc i formyl powinny być usunięte przed procedurą rozszczepiania. Procedura jest kompatybilna z ochroną Asp(OBzl), Glu(OBzl) i Lys(ClZ) (Metoda 7). Należy pamiętać, że żywica peptydowa powinna być umyta i dobrze wysuszona przed rozszczepieniem.

Metoda 7: Rozszczepianie HBr

250 mg skali

1. Umieść 250 mg wysuszonej żywicy w kolbie okrągłodennej z mieszadłem magnetycznym i wymieszaj z 500 mg pentametylobenzenu, 600 µL tioanizolu i 10 ml TFA.
2. Do tej zawiesiny dodać 400 µL 30% HBr/kwas octowy (5 M) i mieszać przez 60-90 min.
3. Usuń żywicę przez filtrację i odparuj filtrat pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 30°C po zakończeniu reakcji.
4. Peptyd rozcieńczyć 50 ml suchego eteru i wyizolować jak opisano w Metoda 8.

Post-cleavage work-up

Nie wyrzucać nośnika żywicznego ani eteru do czasu zakończenia analizy peptydu. Oba mogą być przechowywane pod azotem lub argonem w temperaturze 4°C, aby zapobiec utlenianiu.

Otrącanie eterem

Większość protokołów rozszczepiania obejmuje wytrącanie surowego rozszczepionego peptydu przy użyciu zimnego eteru etylowego. Poniżej przedstawiono ogólne procedury obróbki po rozszczepieniu.

Metoda 8: Obróbka po rozszczepieniu

Izolację i obróbkę peptydów można osiągnąć przez wytrącanie eterem (1) lub wirowanie (2). W przypadku peptydów rozpuszczalnych w wodzie można zastosować metodę opisaną w krokach 3-6.

1. Wytrącanie: Przefiltrować wytrącony peptyd przez utwardzoną bibułę filtracyjną w lejku Hirscha pod lekką próżnią. Przemyć osad zimnym eterem, rozpuścić peptyd w odpowiednim buforze wodnym i liofilizować.
2. Wirowanie: Dodać niewielką objętość eteru metylowo-butylowego do pozostałości i dokładnie rozcierać aż do uzyskania wolnej zawiesiny. Przenieść zawiesinę do czystej probówki wirówkowej, uszczelnić i odwirować.  Istotne jest, aby do tego procesu używać wirówki beziskrowej.  Ostrożnie zdekantować eter z probówki. W razie potrzeby powtórzyć płukanie eterem. Rozpuścić pozostałą substancję stałą w odpowiednim buforze wodnym i liofilizować.
3. Peptydy rozpuszczalne w wodzie: Po wytrąceniu dodać wodę do pozostałości i przenieść mieszaninę do rozdzielacza. Może być konieczne dodanie niewielkiej ilości AcOH w celu ułatwienia rozpuszczania.
4. Dobrze wstrząsnąć zakorkowanym lejkiem. Zwolnij korek i pozwól dwóm warstwom rozdzielić się na stojąco. Wyizoluj dolną (wodną) warstwę.
5. Dodaj więcej wody do lejka i powtórz krok 4 trzy razy. Usuń górną (eteryczną) warstwę i przechowuj w czystej kolbie. Ponownie umieść połączone ekstrakty wodne w rozdzielaczu.
6. Dodaj niewielką ilość świeżego eteru dietylowego i powtórz krok 4 dwa lub trzy razy, za każdym razem usuwając warstwę eteryczną i ponownie umieszczając warstwę wodną w rozdzielaczu. Zebrać warstwę wodną do czystej kolby i liofilizować.

W metodach opisanych powyżej, wydajność peptydu można często zwiększyć, jeśli TFA zostanie najpierw usunięty za pomocą wyparki obrotowej (wyposażonej w zimny palec CO₂/aceton, pompę olejową i pułapkę kwasową) przed etapem wytrącania eteru. W większości przypadków, po dodaniu eteru, peptyd przywiera do ścianek kolby reakcyjnej, umożliwiając szybkie i łatwe usunięcie zmiataczy poprzez wielokrotne przemywanie eterem. Uwaga: mieszaniny rozszczepiające zawierające TFMSA i HBF₄ nie powinny być odparowywane do sucha.

Ponieważ peptydy przygotowane przy użyciu metody rozszczepiania o niskiej i wysokiej zawartości HF mogą zawierać rozpuszczalne w wodzie pochodne sulfonowe, zaleca się ich usunięcie bezpośrednio przed liofilizacją, ponieważ w warunkach obojętnych lub lekko zasadowych mogą one powodować alkilację reszt metioniny i cysteiny.

Referencje

1. Stewart J. et al. in “Progress in Peptide Research”, S. Lande (Ed.), 1972, pp. 52..

2. Stewart J, Young J. "Solid Phase Peptide Synthesis”, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984..

3. Omon Y. 1976. et al. (1976) Chem. Lett., , 85..

4. Tam JP, Heath WF, Merrifield RB. 1983. An SN2 deprotection of synthetic peptides with a low concentration of hydrofluoric acid in dimethyl sulfide: evidence and application in peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc.. 105(21):6442-6455. https://doi.org/10.1021/ja00359a014

5. FUJII N, OTAKA A, IKEMURA O, HATANO M, OKAMACHI A, FUNAKOSHI S, SAKURAI M, SHIOIRI T, YAJIMA H. 1987. Studies on peptides. CLII. Hard acid deprotecting procedure for peptide synthesis.. Chem. Pharm. Bull.. 35(8):3447-3452. https://doi.org/10.1248/cpb.35.3447

6. Merrifield RB, Vizioli LD, Boman HG. 1982. Synthesis of the antibacterial peptide cecropin A(1-33). Biochemistry. 21(20):5020-5031. https://doi.org/10.1021/bi00263a028

7. Tam J. et al. (1988) Pept. Res., 1, 6..

8. Sano S, Kawanishi S. 1975. Hydrogen fluoride-anisole catalyzed reaction with glutamic acid containing peptides. J. Am. Chem. Soc.. 97(12):3480-3484. https://doi.org/10.1021/ja00845a033

9. Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., Foster City, 1990..

10. Yajima H. et al. (1974) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 108..

11. Tam JP, Heath WF, Merrifield R. 1982. Improved deprotection in solid phase peptide synthesis: quantitative reduction of methionine sulfoxide to methionine during HF cleavage. Tetrahedron Letters. 23(29):2939-2942. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)87499-7

12. Yajima H, Fujii N, Funakoshi S, Watanabe T, Murayama E, Otaka A. 1988. New strategy for the chemical synthesis of proteins. Tetrahedron. 44(3):805-819. https://doi.org/10.1016/s0040-4020(01)86118-4

13. Houghten RA, Li CH. 1979. Reduction of sulfoxides in peptides and proteins. Analytical Biochemistry. 98(1):36-46. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90702-4

14. NOMIZU M, INAGAKI Y, YAMASHITA T, OHKUBO A, OTAKA A, FUJII N, ROLLER PP, YAJIMA H. Two-step hard acid deprotection/cleavage procedure for solid phase peptide synthesis. 37(2):145-152. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb00095.x

15. Wang S. (1992). et al. Int. J. Peptide Protein Res., 40, 344..