Przezwyciężanie agregacji w syntezie peptydów w fazie stałej

• Secondary Amino Acid Surrogates
• Pseudoproline Dipeptides
• Protokoły stosowania Pseudoproline Dipeptides
• DMB Dipeptides
• DMB/HMB Amino Acids
• Deprotection
• Solubilization of Aggregated Sequences

Struktura 3D, a w konsekwencji bioaktywność poszczególnych białek, jest w dużej mierze zdeterminowana przez pierwotną sekwencję aminokwasów składowych. Ta nieodłączna skłonność łańcuchów peptydowych do tworzenia uporządkowanych struktur jest główną przyczyną wysoce specyficznej dla sekwencji zmienności wydajności syntetycznej napotykanej podczas montażu peptydów. Gdy peptyd jest wydłużony, może tworzyć struktury drugorzędowe, które powodują agregację łańcucha peptydowego, co skutkuje niższymi szybkościami reakcji. Efekty mogą wahać się od subtelnego spowolnienia do całkowitego niepowodzenia zarówno reakcji deprotekcji, jak i acylacji.

W takich skrajnych przypadkach peptyd stał się nierozpuszczalny i nie jest już dostępny do reakcji.

Początek poważnej agregacji w syntezie wsadowej jest zwykle wskazywany przez kurczenie się matrycy żywicznej, podczas gdy w syntezie w przepływie ciągłym jest wykrywany przez spłaszczenie i poszerzenie profilu deprotekcji. W takich okolicznościach zwykłe testy sprzęgania z ninhydryną lub TNBS często nie są już wiarygodne i mogą dawać fałszywie ujemne wyniki.

Łatwość montażu danej sekwencji jest ogólnie trudna do przewidzenia i jest jednym z czynników, które sprawiają, że synteza peptydów jest interesująca i stanowi wyzwanie. Peptydy zawierające odcinki sąsiadujących aminokwasów hydrofobowych, takich jak Ala, Val, Ile, a także te zawierające aminokwasy, które mogą tworzyć wewnątrzłańcuchowe wiązania wodorowe, takie jak Gln, Ser i Thr, są często trudne do wykonania. Z tego powodu, generalnie lepiej jest przyjąć od samego początku strategie syntetyczne, które łagodzą skutki tworzenia struktury, zamiast próbować odgadnąć, które peptydy mogą być problematyczne i marnować czas i zasoby na powtarzanie nieudanych syntez. W przypadku sekwencji peptydowych dłuższych niż 20 aminokwasów zdecydowanie zaleca się monitorowanie montażu peptydu za pomocą małych rozszczepień TFA.

Większość podejść opracowanych w celu złagodzenia tego problemu próbuje poprawić rozpuszczalność kompleksu peptyd-żywica. Obejmują one stosowanie dipolarnych rozpuszczalników aprotycznych, takich jak DMF, DMSO lub NMP, sole chaotopowe, specjalne koktajle rozpuszczalników, takie jak "Magic Mixture"lub żywice polarne na bazie PEG, takie jak NovaSyn^® TG, NovaPEG lub PEGA  (Tabela 1). Stopień usieciowania żywicy polistyrenowej z DVB może również odgrywać kluczową rolę i nie powinien być wyższy niż 1%, w przeciwnym razie prawidłowe pęcznienie może zostać zahamowane.  Funkcjonalizacja żywicy jest kolejnym ważnym czynnikiem, przy czym żywice o wysokim obciążeniu nasilają efekty agregacji, i właśnie z tego powodu linia produktów Novabiochem^® oferuje specjalne wersje o niskim obciążeniu najpopularniejszych nośników stosowanych do Fmoc SPPS. Wybór grupy zabezpieczającej łańcuch boczny może również wpływać na solwatację peptydów. Podstawienie Ser(tBu) lub Thr(tBu) pochodnymi Trt,  lub Lys(Boc) pochodną Lys(Tfa)  może mieć korzystny wpływ. Jednak najbardziej uniwersalnym sposobem poprawy wydajności syntezy jest odwracalna ochrona szkieletu amidowego kluczowych reszt poprzez wprowadzenie drugorzędowych surogatów aminokwasów

W celu szczegółowego omówienia sposobu identyfikacji i przezwyciężania skutków agregacji, czytelnik jest odsyłany do doskonałego artykułu Quibell & Johnson.¹⁰

Tabela 1: Pokonywanie trudnych sekwencji.

Żywice Używaj żywic o dobrych właściwościach pęcznienia, takich jak rodzina NovaPEG, PEGA i NovaSyn® TG oraz żywic o niskim stopniu podstawienia do syntezy wsadowej.

Rozpuszczalniki Używaj DMF, DMA, NMP lub 25% DMSO w DMF zamiast DCM.

Czas Użyj dłuższego czasu sprzęgania i/lub podwójnego sprzęgania.

Sole chaotropowe Przemyć żywicę roztworami soli chaotropowych takich jak 0,8 M NaClO4 lub LiCl lub 4 M KSCN w DMF przed sprzęganiem lub dodać je do mieszaniny sprzęgającej.

Odczynniki sprzęgające Użyj różnych metod aktywacji, takich jak PyBOP®, PyBOP®/HOBt, HBTU, TBTU, PyBroP® i HATU i pozwolić na dłuższy czas reakcji.

Ochrona wiązania peptydowego przy użyciu substytutów aminokwasów drugorzędowych Włącz pochodną chronioną Dmb lub Hmb lub dipeptyd pseudoproliny dla każdej szóstej reszty, jeśli to możliwe.

"Magiczna mieszanina" Użyj mieszaniny DCM/DMF/NMP (1:1:1) z 1% Triton X100 i 2 M etylenowęglanu w temperaturze 55 °C jako układu rozpuszczalników do acylowania i 20% piperydyny w DCM/DMF/NMP (1:1:1) z 1% Triton X100 do usuwania Fmoc.

Surogaty aminokwasów drugorzędowych

Surogaty aminokwasów drugorzędowych są analogami proliny lub N-alkiloaminokwasów, które pochodzą ze standardowych aminokwasów pierwszorzędowych poprzez odwracalną ochronę wiązania amidowego szkieletu. Ich działanie polega na naśladowaniu naturalnej skłonności proliny i aminokwasów N-alkilowych do zakłócania tworzenia struktur drugorzędowych podczas montażu peptydów. Ich zastosowanie prowadzi do lepszej i bardziej przewidywalnej kinetyki acylacji i deprotekcji, co skutkuje wyższą czystością i rozpuszczalnością surowych produktów, łatwiejszym oczyszczaniem HPLC i lepszą wydajnością, przy mniejszej potrzebie powtarzania nieudanych syntez. Okazały się one szczególnie skuteczne w syntezie trudnych do syntezy peptydów, długich peptydów/małych białek, i cyklicznych peptydów, umożliwiając w wielu przypadkach produkcję peptydów, które w przeciwnym razie nie mogłyby zostać wytworzone.

Novabiochem dostarcza obecnie trzy rodzaje surogatów aminokwasów drugorzędowych: dipeptydy pseudoproliny; dipeptydy Dmb; aminokwasy Dmb/Hmb  (Rysunek 1). Wszystkie działają na tej samej zasadzie, tymczasowo wprowadzając aminokwas rozbijający strukturę do sekwencji peptydu.  Efekty mogą być dalekosiężne, przy czym tworzenie struktur często jest odkładane nawet na sześć reszt lub całkowicie eliminowane.  Po złożeniu peptydu, traktowanie TFA rozszczepia grupę zabezpieczającą wiązanie amidowe, regenerując natywną sekwencję zawierającą pierwotny aminokwas, z którego uzyskano substytut aminokwasu wtórnego.

Rysunek 1. Aminokwasy N-alkilowe zaburzające strukturę drugorzędową.

Rysunek 2. Projektowanie syntezy z użyciem surogatów aminokwasów drugorzędowych. Ogólne wytyczne dotyczące stosowania surogatów aminokwasów drugorzędowych

• Optymalne wyniki uzyskuje się, jeśli surogaty aminokwasów są oddalone od siebie o 5-6 reszt w całej sekwencji.
• Optymalna odległość między surogatem aminokwasu a resztą Pro wynosi 5-6 reszt aminokwasowych.
• Minimalna odległość między surogatem aminokwasu a innym surogatem aminokwasu lub resztą Pro wynosi 2 reszty.
• Dąż do wstawienia surogatu aminokwasu przed regionami reszt hydrofobowych.

Pseudoproline Dipeptides

Mutter'są niewątpliwie najskuteczniejszymi i najprostszymi w użyciu surogatami aminokwasów drugorzędowych, ale są odpowiednie tylko do stosowania w sekwencjach zawierających Cys, Ser lub Thr. Składają się one z dipeptydu, w którym reszta Cys lub Ser/Thr została odwracalnie zabezpieczona jako podobna do proliny tiazolidyna lub oksazolidyna. Powodem, dla którego reszta pseudoproliny jest wprowadzana jako dipeptyd, jest uniknięcie konieczności acylowania utrudnionego azotu oksazolidyny. Ma to dodatkową zaletę polegającą na wydłużeniu łańcucha peptydowego o dwie reszty w jednym kroku.

Dipeptydy te są niezwykle łatwe w użyciu: wystarczy zastąpić resztę Cys, Ser lub Thr wraz z poprzedzającą ją resztą aminokwasową w sekwencji peptydowej odpowiednim dipeptydem pseudoproliny (Rysunek 3). Natywna sekwencja jest regenerowana po rozszczepieniu i deprotekcji. Aby osiągnąć maksymalne korzyści, ważne jest przestrzeganie powyższych wytycznych.

Pozycjonowanie reszt pseudoprolinowych w regularnych odstępach czasu okazało się niezwykle skutecznym podejściem do syntezy długich i amyloidogennych peptydów. Przykładem tego podejścia jest synteza 95-cio resztowego peptydu o niezwykłej czystości poprzez szybkie zastosowanie 7 dipeptydów pseudoprolinowych w syntezie 101mera związanego z domeną d2 receptora VEGF, i równoległej produkcji analogów ubikwityny.

Dipeptydy pseudoprolinowe mogą być wprowadzane w taki sam sposób jak inne pochodne aminokwasów. Dipeptyd pseudoproliny został sprzężony przy użyciu odczynników aktywujących fosfonium i aminium, takich jak PyBOP^®, HBTU, TBTU, i HATU metody aktywacji (Metoda 1a), jak również z karbodiimidowymi strategiami sprzęgania, takimi jak DIPCDI/HOBt  (Metoda 3-15a).

Na zautomatyzowanych urządzeniach najprostszym podejściem jest użycie takiej samej ilości dipeptydu pseudoproliny jak każdego innego aminokwasu, ponieważ pozwala to uniknąć konieczności przeprogramowania cykli sprzęgania lub ręcznej interwencji w syntezę. Zaprogramuj instrument, aby dodać resztę Cys, Ser lub Thr i pamiętaj, aby pominąć w programie syntezy cykl dla następnego aminokwasu, ponieważ zostanie on wprowadzony jako część dipeptydu pseudoproliny.

Używając 5-krotnego nadmiaru fosfoniowego lub aminowego aktywowanego dipeptydu pseudoproliny do funkcjonalności żywicy, reakcje sprzęgania są zwykle zakończone w ciągu 1 godziny. Można również stosować niższe nadmiary odczynnika, ale wtedy wskazane jest sprawdzenie kompletności reakcji za pomocą testu aminowego, takiego jak test Kaisera lub TNBS.

Regeneracja cysteiny, seryny lub treoniny z pseudoproliny zachodzi w trakcie reakcji rozszczepiania TFA przy użyciu standardowych koktajli rozszczepiających, takich jak TFA/woda/TIS (95:2,5:2,5), i jest zazwyczaj zakończona w ciągu 3 godzin.

Rysunek 3. Związek między sekwencją peptydu a dipeptydem pseudoproliny.

Protokoły użycia dipeptydów pseudoproliny

Metoda 1a: Ręczne sprzęganie pseudoproliny & Dmb dipeptydów

Aktywacja fosfoniowo-aminowa

1. Rozpuścić pochodną (5 eq.) i odczynnik sprzęgający (PyBOP^®, TBTU, HBTU, HCTU, lub HATU, 5 eq.) w minimalnej objętości DMF lub NMP.
2. Dodaj DIPEA (10 eq.) i dokładnie wymieszaj.
3. Dodaj natychmiast do żywicy peptydowej zabezpieczonej Fmoc i mieszaj przez 1-2 h. Sprawdź zakończenie sprzęgania za pomocą testu TNBS. Jeśli reakcja nie jest kompletna, należy wydłużyć czas sprzęgania lub powtórzyć reakcję używając świeżych odczynników.

Aktywacja DIPCDI/HOBt

1. Rozpuścić pochodną (3 eq.) i HOBt (3 eq.) w minimalnej objętości DMF/DCM (2:1).
2. Dodaj DIPCDI (3 eq.) i dokładnie wymieszaj.
3. Pozostaw do aktywacji na 10 minut, a następnie dodaj do żywicy peptydowej zabezpieczonej Fmoc i mieszaj przez 1-2 h. Sprawdź zakończenie sprzęgania testem TNBS. Jeśli reakcja nie jest kompletna, wydłuż czas sprzęgania lub powtórz reakcję używając świeżych odczynników.

Metoda 1b: Automatyczne sprzęganie dipeptydów pseudoproliny

Instrumenty wykorzystujące suche Fmoc-aminokwasy we wkładach 

1. Zapakuj puste fiolki lub wkłady z odpowiednią ilością pseudoproliny lub dipeptydu Dmb dla protokołów instrumentu (tj, 1 mmol dla ABi 433 i 0,8 mmol dla Pioneer).
2. Zaprogramuj urządzenie do sprzęgania dipeptydu jako reszty Ser, Thr lub Gly (sprzęganie 1 h, aktywacja HBTU, HATU). Pomiń cykl aminokwasowy dla następnego aminokwasu.
3. Można stosować mniejsze nadmiary dipeptydów, ale objętości dostarczania odczynników sprzęgających i zasadowych będą musiały zostać zmodyfikowane w protokołach sprzęgania, aby utrzymać prawidłowy stosunek dipeptydu/odczynnika sprzęgającego/bazy (1:1:2). Alternatywnie, urządzenie można zaprogramować tak, aby zatrzymywało się po etapie płukania po usunięciu Fmoc, a dipeptyd był sprzęgany ręcznie poprzez dodanie roztworu aktywowanej pochodnej do naczynia reakcyjnego.

Instrumenty, które igłowo dozują roztwory odczynników z fiolek (ACT 396, Zinsser 350)

1. Rozpuścić pochodną w DMF lub NMP do dokładnie takiego samego stężenia jak standardowe pochodne Fmoc-aminokwasów w fiolce z odczynnikiem.
2. Umieść fiolkę zawierającą   dipeptyd w odpowiedniej pozycji stojaka autosamplera.
3. Zaprogramuj urządzenie do sprzęgania dipeptydu jako reszty Ser, Thr lub Gly (sprzęganie 1 h, aktywacja HBTU, HATU). Pomiń cykl aminokwasowy dla następnego aminokwasu.

Aparaty wykorzystujące roztwory podstawowe Fmoc-aminokwasów z dedykowanymi liniami rozpuszczalników (Protein Technologies Symphony)

Chociaż całkowicie wykonalne jest stosowanie wstępnie rozpuszczonych roztworów dipeptydów pseudoprolinowych w aparatach takich jak Symphony, może to być dość marnotrawne, ponieważ linie rozpuszczalników odczynników musiałyby zostać zalane roztworem dipeptydu przed użyciem.W przypadku takich aparatów cykl powinien być zaprogramowany tak, aby zatrzymać się po etapie płukania po usunięciu Fmoc, a etapy "dodawania" aminokwasu i odczynnika sprzęgającego w cyklu zastąpić etapem "bez" odczynnika. Dipeptyd można następnie połączyć ręcznie, dodając roztwór aktywowanej pochodnej do naczynia reakcyjnego.

Dipeptydy Dmb

.Dipeptydy Dmb działają dokładnie w ten sam sposób i oferują wiele takich samych korzyści jak dipeptydy pseudoprolinowe, ale dla sekwencji zawierających Gly, tj.szybsze i bardziej przewidywalne reakcje acylacji, wyższą wydajność i czystość surowych produktów oraz mniej nieudanych syntez. Podobnie jak w przypadku dipeptydów pseudoprolinowych, wstawienie dipeptydu Dmb wprowadza dwa aminokwasy jednocześnie i pozwala uniknąć trudnej acylacji reszty (Dmb)Gly.

Użycie ich jest bardzo proste, wystarczy zastąpić resztę Gly wraz z poprzedzającą ją resztą aminokwasową w sekwencji peptydowej odpowiednim dipeptydem (Rysunek 4). Aby uzyskać najlepsze wyniki podczas stosowania dipeptydów Dmb, najlepiej postępować zgodnie z wytycznymi przedstawionymi na Rysunku 2. Dipeptydy Dmb mogą być wprowadzane przy użyciu dowolnej standardowej metody sprzęgania.

W celu uzyskania najlepszych wyników podczas stosowania dipeptydów Dmb, najlepiej postępować zgodnie z Rysunkiem 2.

Rysunek 4. Zasady stosowania dipeptydów Dmb

Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH jest szczególnie przydatny do poprawy syntezy peptydów zawierających powszechnie występujący motyw Gly-Gly. Produkcja takich peptydów jest często problematyczna ze względu na ich skłonność do agregacji i trudności w oddzielaniu ściśle eluujących produktów ubocznych desGly. Wstawienie Gly-(Dmb)Gly do sekwencji peptydowej ma takie same korzyści dla wydajności syntezy jak dipeptyd pseudoproliny, zapobiegając agregacji i poprawiając kinetykę acylowania i deprotekcji. Stwierdzono, że zastosowanie tej pochodnej jest niezbędne do syntezy peptydów związanych z nukleoliną.

Sekwencja dipeptydowa Ala-Gly jest często spotykana w hydrofobowych peptydach transmembranowych i amyloidogennych. Dlatego Fmoc-Ala-(Dmb)Gly-OH powinien okazać się użytecznym narzędziem do syntezy takich peptydów.

Dla peptydów zawierających motyw Asp-Gly, Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH jest wysoce zalecany, ponieważ jego zastosowanie do wprowadzenia dipeptydu Asp-Gly całkowicie zapobiega tworzeniu się aspartymidu.

Aminokwasy Dmb/Hmb

.W przeciwieństwie do wcześniej opisanych dipeptydów pseudoproliny i Dmb, te pochodne są używane do wprowadzania reszt chronionych przed amidem wstecznym indywidualnie, a nie jako dipeptydy. Jednak po włączeniu do peptydu działają one dokładnie w taki sam sposób jak dipeptydy pseudoproliny i Dmb, zakłócając tworzenie struktury drugorzędowej, aby zapewnić takie samo zwiększenie wydajności syntetycznej.

Stosując takie pochodne aminokwasów, nie ogranicza się do wprowadzenia ochrony amidowej szkieletu w resztach Gly, Ser lub Thr, jak ma to miejsce w przypadku pochodnych dipeptydów. Jednak wadą tego podejścia jest to, że konieczne staje się teraz sprzężenie z utrudnioną aminą drugorzędową reszty Hmb lub Dmb.

Sheppard i współpracownicy zaprojektowali swoje pochodne Hmb, aby złagodzić ten problem.Dodanie aminokwasu bezpośrednio po zabezpieczonej Hmb przebiega początkowo poprzez katalizowany wewnętrzną zasadą wychwyt składnika acylowego, dając ester fenylowy, który następnie powoli ulega wewnątrzcząsteczkowemu przeniesieniu acylu O→N, dając pożądany amid trzeciorzędowy (Rysunek 5). Acylowanie (Hmb)Gly jest ogólnie proste i działa dobrze dla większości aminokwasów z większością metod sprzęgania. W przypadku innych reszt Hmb, Sheppard i współpracownicy stwierdzili, że zastosowanie PSA w DCM lub N-karboksyanhydrydach Fmoc dało najlepsze wyniki. Inni autorzy również stwierdzili, że TBTU/HOBt/DIPEA aktywacja i fluorki aminokwasów są skuteczne. W praktyce, gdy łańcuch boczny staje się bardziej nieporęczny, sprzęganie staje się trudniejsze, a przeszkoda steryczna przychodzącego aminokwasu staje się coraz ważniejszym czynnikiem. Stosując fluorki kwasowe, najtrudniejszy przypadek, dodanie Fmoc-Val do (Hmb)Val, można było przeprowadzić z wydajnością 95%, przeprowadzając sprzęganie przez noc w toluenie w temperaturze 80 °C. Pomimo tych ograniczeń, pochodne Hmb okazały się niezwykle skuteczne w szerokim zakresie trudnych i zagregowanych peptydów.

Rysunek 5. Mechanizm acylowania reszt chronionych przez Hmb.

(Hmb)Gly i (Dmb)Gly mają szczególne zastosowanie w syntezie hydrofobowych peptydów amyloidowych i transmembranowych. Sekwencje te są niezwykle trudne do przygotowania przy użyciu konwencjonalnych metod i generalnie nie nadają się do podstawienia pseudoproliną, ponieważ rzadko zawierają wiele reszt serynowych lub treoninowych. Glicyna występuje jednak często w takich peptydach, często w sąsiedztwie reszt hydrofobowych, takich jak Ile, Val i Ala. Dlatego podstawienie Gly przez (Dmb)Gly lub (Hmb)Gly powinno okazać się wysoce skuteczną metodą przezwyciężenia tych problemów. Rzeczywiście, stosując sześć podstawień analogicznej pochodnej (Tmob)Gly, Bayer i współpracownicy byli w stanie przygotować 64-pozostałościowy peptyd transmembranowy o niezwykłej czystości.

Sprzężenie Fmoc-(Dmb)Gly-OH można osiągnąć przy użyciu standardowych metod, takich jak PyBOP^®/DIPEA. Po usunięciu Fmoc za pomocą piperydyny/DMF, amina drugorzędowa glicyny może być acylowana aminokwasami Fmoc za pomocą pojedynczego sprzęgania z PyBrOP^® lub HATU, lub za pomocą wstępnie utworzonych fluorków aminokwasów.(Dmb)Gly jest preferowana w stosunku do (Hmb)Gly w zastosowaniach wymagających acylowania lub fosforylacji po syntezie, ponieważ grupa Dmb nie posiada potencjalnie reaktywnej funkcjonalności hydroksylowej.

Deprotection

Grupy Dmb i Hmb są usuwane w normalnych warunkach wymaganych do ostatecznego rozszczepienia i deprotection peptydu. Zalecamy jednak dodanie około 2% TIS do mieszaniny rozszczepiającej.

UWAGA: produkty rozszczepienia Dmb i Hmb mogą powodować modyfikację łańcucha bocznego niezabezpieczonego Trp. Dlatego zdecydowanie zalecamy stosowanie Fmoc-Trp(Boc) we wszystkich syntezach, w których stosowane są te grupy.

Solubilization of Aggregated Sequences

.Acylowanie grupy Hmb bezwodnikiem octowym w obecności DIPEA znacznie zwiększa jej stabilność kwasową, umożliwiając generowanie peptydów zachowujących ochronę Ac-Hmb bezpośrednio po rozszczepieniu TFA w normalnych warunkach.Peptydy zabezpieczone szkieletem wykazują znacznie lepsze właściwości rozpuszczalności, ułatwiając oczyszczanie za pomocą HPLC sekwencji, które w innym przypadku byłyby trudne do usunięcia. Wolny peptyd można zregenerować po deacetylacji 20% piperydyną w DMF przez rozszczepienie TFA (Rysunek 6).

Rysunek 6. Synteza peptydów chronionych Ac-Hmb.

Referencje

1. Epton R. 1993 . Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis Andover Intercept Ltd..1.

2. S, Rivier J. 1992 . “Peptides, Chemisty, Structure & Biology: . pp. 569.. Leiden: Proc. 12th American Peptide Symposium” J. ESCOM.

3. Epton R. 1990 . Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis Birmingham . pp. 1.3.. UK: SPCC Ltd. .

4. Epton R. 1994. Innovation & Perspectives in Solid Phase Synthesis, 3rd International Symposium. pp. 711. Birmingham: Mayflower Scientific Ltd .

5. Bayer E. 1991. Towards the Chemical Synthesis of Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 30(2):113-129. https://doi.org/10.1002/anie.199101133

6. Meldal M. 1992. Pega: a flow stable polyethylene glycol dimethyl acrylamide copolymer for solid phase synthesis.. Tetrahedron Letters. 33(21):3077-3080. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)79604-3

7. PUGH KC, YORK EJ, STEWART JM. Effects of resin swelling and substitution on solid phase synthesis. 40(3-4):208-213. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00293.x

8. BARLOS K, GATOS D, KOUTSOGIANNI S. Fmoc/Trt-amino acids: comparison to Fmoc/tBu-amino acids in peptide synthesis. 51(3):194-200. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1998.tb01216.x

9. Atherton E, Woolley V, Sheppard RC. Internal association in solid phase peptide synthesis. Synthesis of cytochrome C residues 66?104 on polyamide supports. J. Chem. Soc., Chem. Commun..(20):970-971. https://doi.org/10.1039/c39800000970

10. Quibell M, Johnson T. 2005 . Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach . pp. 115.. Oxford Oxford University Press .

11. Toniolo C, Bonora GM, Mutter M, Pillai VNR. 1981. Makromol. Chem.. 182(7):1997-2005. https://doi.org/10.1002/macp.1981.021820712

12. Toniolo C, Bonora GM, Mutter M, Pillai VNR. 1981. Makromol. Chem.. 182(7):2007-2014. https://doi.org/10.1002/macp.1981.021820713

13. BEDFORD J, HYDE C, JOHNSON T, JUN W, OWEN D, QUIBELL M, SHEPPARD R. Amino acid structure and ?difficult sequences? in solid phase peptide synthesis. 40(3-4):300-307. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00305.x

14. White Pea. 1988 . Peptides 1998, Proc. of 25th European Peptide Symposium. pp. 120.. Budapest : Akadémiai Kiadó .

15. HYDE C, JOHNSON T, OWEN D, QUIBELL M, SHEPPARD R. Some ?difficult sequences? made easy. 43(5):431-440. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1994.tb00541.x

16. von Eggelkraut-Gottanka R, Machova Z, Grouzmann E, Beck-Sickinger AG. 2003. Semisynthesis and Characterization of the First Analogues of Pro-Neuropeptide Y. ChemBioChem. 4(5):425-433. https://doi.org/10.1002/cbic.200200546

17. Shabanpoor F, Bathgate RAD, Hossain MA, Giannakis E, Wade JD, Hughes RA. 2007. Design, synthesis and pharmacological evaluation of cyclic mimetics of the insulin-like peptide 3 (INSL3) B-chain. J. Pept. Sci.. 13(2):113-120. https://doi.org/10.1002/psc.807

18. White P, Keyte JW, Bailey K, Bloomberg G. 2004. Expediting the Fmoc solid phase synthesis of long peptides through the application of dimethyloxazolidine dipeptides. J. Peptide Sci.. 10(1):18-26. https://doi.org/10.1002/psc.484

19. White P, Keyte J, Bailey K, Bloomberg G. 2003 . BIOPOLYMERS 111 RIVER ST. HOBOKEN. NJ 07030 USA : JOHN WILEY & SONS INC..

20. García-Martín F, White P, Steinauer R, Côté S, Tulla-Puche J, Albericio F. 2006. The synergy of ChemMatrix resin® and pseudoproline building blocks renders Rantes, a complex aggregated chemokine. Biopolymers. 84(6):566-575. https://doi.org/10.1002/bip.20564

21. Abu-Baker S, Lorigan GA. 2006. Phospholamban and Its Phosphorylated Form Interact Differently with Lipid Bilayers:  A31P,2H, and13C Solid-State NMR Spectroscopic Study?. Biochemistry. 45(44):13312-13322. https://doi.org/10.1021/bi0614028

22. Goncalves V, Gautier B, Huguenot F, Leproux P, Garbay C, Vidal M, Inguimbert N. 2009. Total chemical synthesis of the D2 domain of human VEGF receptor 1. J. Pept. Sci.. 15(6):417-422. https://doi.org/10.1002/psc.1133

23. El?Oualid F, Merkx R, Ekkebus R, Hameed DS, Smit JJ, de?Jong A, Hilkmann H, Sixma TK, Ovaa H. 2010. Chemical Synthesis of Ubiquitin, Ubiquitin-Based Probes, and Diubiquitin. Angew. Chem. Int. Ed.. 49(52):10149-10153. https://doi.org/10.1002/anie.201005995

24. Bavikar SN, Spasser L, Haj-Yahya M, Karthikeyan SV, Moyal T, Ajish?Kumar KS, Brik A. 2012. Chemical Synthesis of Ubiquitinated Peptides with Varying Lengths and Types of Ubiquitin Chains to Explore the Activity of Deubiquitinases. Angew. Chem.. 124(3):782-787. https://doi.org/10.1002/ange.201106430

25. Nagorny P, Sane N, Fasching B, Aussedat B, Danishefsky SJ. 2012. Probing the Frontiers of Glycoprotein Synthesis: The Fully Elaborated ?-Subunit of the Human Follicle-Stimulating Hormone. Angew. Chem.. 124(4):999-1003. https://doi.org/10.1002/ange.201107482

26. Coïc Y, Lan CL, Neumann J, Jamin N, Baleux F. 2010. Slightly modifying pseudoproline dipeptides incorporation strategy enables solid phase synthesis of a 54 AA fragment of caveolin-1 encompassing the intramembrane domain. J. Peptide Sci.. 16(2):98-104. https://doi.org/10.1002/psc.1203

27. Ehrlich A, Heyne H, Winter R, Beyermann M, Haber H, Carpino LA, Bienert M. 1996. Cyclization ofall-l-Pentapeptides by Means of 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole-Derived Uronium and Phosphonium Reagents. J. Org. Chem.. 61(25):8831-8838. https://doi.org/10.1021/jo951108d

28. Schmiedeberg N, Kessler H. 2002. Reversible Backbone Protection Enables Combinatorial Solid-Phase Ring-Closing Metathesis Reaction (RCM) in Peptides. Org. Lett.. 4(1):59-62. https://doi.org/10.1021/ol016891c

29. Haack T, Mutter M. 1992. Serine derived oxazolidines as secondary structure disrupting, solubilizing building blocks in peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 33(12):1589-1592. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)91681-2

30. Haack T, Mutter M. 1992. Serine derived oxazolidines as secondary structure disrupting, solubilizing building blocks in peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 33(12):1589-1592. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)91681-2

31. Zahariev S, Guarnaccia C, Zanuttin F, Pintar A, Esposito G, Maravi? G, Krust B, Hovanessian AG, Pongor S. 2005. Efficient synthesis and comparative studies of the arginine and N?,N?-dimethylarginine forms of the human nucleolin glycine/arginine rich domain. J. Peptide Sci.. 11(1):17-28. https://doi.org/10.1002/psc.577

32. JOHNSON R. 1995. Prerequisites from Algebra, Geometry and Trigonometry.11-23. https://doi.org/10.1533/9780857099860.11

33. Sampson W, Patsiouras H, Ede N. 1999 . The synthesis of ‘difficult’peptides using 2‐hydroxy‐4‐methoxybenzyl or pseudoproline amino acid building blocks: a comparative study. . Journal of peptide science: . 5(9 ):403-409.

34. Cardona V, Eberle I, Barthélémy S, Beythien J, Doerner B, Schneeberger P, Keyte J, White PD. 2008. Application of Dmb-Dipeptides in the Fmoc SPPS of Difficult and Aspartimide-Prone Sequences. Int J Pept Res Ther. 14(4):285-292. https://doi.org/10.1007/s10989-008-9154-z

35. Johnson T, Quibell M, Owen D, Sheppard RC. A reversible protecting group for the amide bond in peptides. Use in the synthesis of ?difficult sequences?. J. Chem. Soc., Chem. Commun..(4):369-372. https://doi.org/10.1039/c39930000369

36. Johnson T, Quibell M. 1994. The N-(2-hydroxybenzyl) protecting group for amide bond protection in solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 35(3):463-466. https://doi.org/10.1016/0040-4039(94)85081-x

37. Packman H. 1994. Surgical, Non-surgical Therapies. The Journal of the American Dental Association. 125(12):1540-1542. https://doi.org/10.14219/jada.archive.1994.0242

38. SIMMONDS RG. Use of the Hmb backbone-protecting group in the synthesis of difficult sequences. 47(1-2):36-41. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1996.tb00807.x

39. Reicosky D. 1997. 49(1/3):273-285. https://doi.org/10.1023/a:1009766510274

40. Bacardit et al. J. 1995 . Poster 190 presented at the 15th American Peptide Symposium. [dissertation]. Nashville:

41. Ramage R, Epton R. 1996 . Proc. 24th European Peptide Symposium Mayflower Scientific Ltd . p. pp 497.

42. Quibell M, Turnell WG, Johnson T. 1994. Reversible modification of the acid labile 2-hydroxy-4-methoxybenzyl(Hmb) amide protecting group: A simple scheme yielding backbone substituted free peptides. Tetrahedron Letters. 35(14):2237-2238. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)76807-9

43. Quibell M, Turnell WG, Johnson T. 1994. Preparation and Purification of .beta.-Amyloid (1-43) via Soluble, Amide Backbone Protected Intermediates. J. Org. Chem.. 59(7):1745-1750. https://doi.org/10.1021/jo00086a025