Protokół hodowli pierwotnych ludzkich komórek Kupffera wątroby

• Czym są wątrobowe komórki Kupffera?
• Materiały do hodowli wątrobowych komórek Kupffera
• Metody hodowli wątrobowych komórek Kupffera
• Wyniki hodowli wątrobowych komórek Kupffera

Czym są wątrobowe komórki Kupffera?

Wątrobowe komórki Kupffera, znane również jako komórki Browicza-Kupffera i makrofagi gwiaździste, są wyspecjalizowanymi makrofagami w wątrobie, które wyściełają ściany sinusoid. Komórki Kupffera mogą aktywować makrofagi i są stale narażone na działanie bakterii jelitowych, resztek mikrobiologicznych i endotoksyn bakteryjnych.

Wątrobowe komórki Kupffera są ściśle zaangażowane w odpowiedź wątroby na infekcje, toksyny, niedokrwienie, resekcję i inne stresy. Po aktywacji komórki Kupffera uwalniają różne produkty, w tym cytokiny, prostanoidy, tlenek azotu i reaktywne formy tlenu. Te uwolnione cząsteczki regulują inne komórki Kupffera i sąsiednie komórki, takie jak hepatocyty, komórki gwiaździste, komórki śródbłonka i inne komórki odpornościowe, które przemieszczają się przez wątrobę. Ludzkie wątrobowe komórki Kupffera są często charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej dla rozkładu populacji i są dodatnie dla CD11b, CD14 i CD68¹. In vitro, komórki te nie proliferują i nie mogą być pasażowane.

Nasze kriokonserwowane wątrobowe komórki Kupffera pochodzą z ludzkiej wątroby, a każdy dawca wyraził udokumentowaną zgodę na wykorzystanie w badaniach narządów lub tkanek nieprzeznaczonych do przeszczepu. Po hodowli pierwotnej komórki te są poddawane kriokonserwacji. Każda partia przechodzi testy pod kątem określonych markerów komórkowych, aktywacji produkcji cytokin po stymulacji LPS i jest objęta gwarancją ≥70% żywotności po rozmrożeniu. W tym protokole pokazujemy, jak rozmrażać, umieszczać na płytkach i hodować pierwotne ludzkie wątrobowe komórki Kupffera.

Materiały do hodowli wątrobowych komórek Kupffera

• Normalne ludzkie wątrobowe komórki Kupffera
  Uwaga: Po otrzymaniu, natychmiast przechowuj kriofiolę(i) w fazie lotnej ciekłego azotu.
• Collagen Type I, Rat Tail
• Tissue culture treated multiwell plates
• Kupffer Maintenance Medium²:

Komponenty	Numer katalogowy	Zapas roboczy	Final Dilution	Final Conc.	Objętość końcowa (mL)
Williams' Medium E	W1878-500ML			1x	470
FBS	ES-009-M			5%	25
Insulina	I9278-5ML	10mg/mL (1.7mM)	1700x	1µM	0.29
Pen/Strep	P7539	100x	100x	1x	5
				Całkowita objętość	500

METODY HEPATYCZNEJ KULTURY KOMÓREK KUPFFERA

Protokoły te zostały wykonane przy użyciu biokomory z przepływem laminarnym klasy II, chyba że bezpośrednio określono inaczej. Stosowane inkubatory były nawilżane i ustawione na 37°C i 5% CO₂. Badacze powinni nosić środki ochrony indywidualnej, w tym okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny.

 Przygotowanie płytki hodowlanej pokrytej kolagenem

1. Utwórz roztwór kolagenu o końcowym stężeniu 56 µg / ml w sterylnym 70% etanolu. Delikatnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia kolagenu.
2. Całkowicie pokryj dno dołka lub kolby roztworem kolagenu/etanolu.
3. Delikatnie obracaj płytką do hodowli komórkowej, aby roztwór kolagenu/etanolu równomiernie pokrył dołki lub dno kolby.
4. Płytki lub kolby wysuszyć na powietrzu w wyciągu z przepływem laminarnym i pozostawić na noc z uchyloną pokrywą lub korkiem, aby zapobiec kondensacji.

Rozmrażanie i umieszczanie komórek Kupffera

Przed rozpoczęciem należy przygotować pożywkę pokrytą kolagenem I (patrz powyższy protokół). NIE należy wstępnie podgrzewać pożywki w celu rozmrożenia komórek. Komórki Kupffera łatwo przyczepiają się do ścianek probówki stożkowej w temperaturze 37°C.

1. Umieść fiolkę z komórkami Kupffera w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i delikatnie obracaj fiolkę, aż komórki zostaną całkowicie rozmrożone. Natychmiast wyjąć fiolkę z łaźni wodnej, wytrzeć do sucha i przepłukać 70% etanolem, a następnie przenieść na sterylne pole. Zdejmij nakrętkę i uważaj, aby nie dotknąć wewnętrznych gwintów.
2. Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml ZIMNEGO (4°C) pożywki dla komórek Kupffera i umieść probówkę na lodzie.
3. Wiruj probówkę z prędkością 500xg przez 5 minut. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnej pożywki dla komórek Kupffera.

Uwaga: osad komórkowy będzie bardzo mały. Ponownie zawiesić przy użyciu mikropitetera P1000, ponieważ ponowne zawieszenie za pomocą pipety serologicznej może prowadzić do zlepiania się komórek.

1. Zlicz komórki za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanu.
2. Rozcieńczyć komórki w WARM Kupffer Cell Medium do 400 000 komórek/ml.
3. Nałożyć 100 000 komórek/cm² na naczynia hodowlane pokryte kolagenem typu I (patrz tabela poniżej)

.

Format	cm2 na studzienkę	Liczba komórek na cm2	Liczba komórek na studzienkę	Łączna liczba komórek na płytkę
Płytka z 384 dołkami	0.056	100,000	5,600	2.15 x 106
96 Well Plate	0.32	100,000	32,000	3.07 x 106
48 Well Plate	1.02	100,000	102,000	4.89 x 106
24 Well Plate	1.94	100,000	194,000	4.66 x 106
12 Well Plate	3.87	100,000	387,000	4.64 x 106
6 Well Plate	9.62	100,000	962,000	5.77 x 106
Naczynie 10cm	56	100,000	N/A	5.60 x 106
60mm Dish	21	100,000	N/A	2.10 x 106
35mm Dish	8	100,000	N/A	800,000
T-25 Flask	25	100,000	N/A	2.50 x 106
T-75 Flask	75	100,000	N/A	7.5 x 106

7. Umieść komórki w nawilżonym inkubatorze 37°C/5% CO₂ i pozwól im przyłączyć się na 4-6 godzin do nocy.

Uwaga: Ludzkie komórki Kupffera można łatwo usunąć za pomocą aspiracji próżniowej. Należy zachować ostrożność.

8. Po przyłączeniu, wymień podłoże na świeże WARM Kupffer Cell Medium.
9. Po 24 godzinach, wymień podłoże na ogrzane Kupffer Cell Medium i kontynuuj eksperyment.

Uwaga: Komórki te NIE proliferują i nie mogą być pasażowane.

Wyniki hodowli komórek Kupffera wątroby

Rysunek 1 Przykładowe obrazy mikroskopowe hodowli komórek Kupffera po a.) 6 godzinach, b.) 24 godzinach i c.) 48 godzinach.

Referencje

1. Seki S, Ikarashi M, Nakashima M, Nakashima H. 2014. New Findings about Liver Kupffer Cells/Macrophages, B Cells and their Functions. J Hepat Res. . 1(1):1003. https://austinpublishinggroup.com/hepatitis/fulltext/hepatitis-v1-id1003.php

2. Su GL, Goyert SM, Fan M, Aminlari A, Gong KQ, Klein RD, Myc A, Alarcon WH, Steinstraesser L, Remick DG, et al. 2002. Activation of human and mouse Kupffer cells by lipopolysaccharide is mediated by CD14. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 283(3):G640-G645. https://doi.org/10.1152/ajpgi.00253.2001