Protokół hodowli pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka zatok wątrobowych

• Czym są komórki śródbłonka zatok wątrobowych?
• Materiały do hodowli komórek śródbłonka zatok wątrobowych
• Metoda hodowli komórek śródbłonka zatok wątrobowych

Czym są komórki śródbłonka zatok wątrobowych (HSEC)?

Człowiecze komórki śródbłonka zatok wątrobowych (HSEC) to wyspecjalizowane komórki śródbłonka w wątrobie, które uczestniczą w klirensie endotoksyny, bakterii i innych związków za pośrednictwem receptorów. Wiadomo również, że HSEC regulują stan zapalny, rekrutację leukocytów i odpowiedź immunologiczną gospodarza na inwazję patogenów. Ludzkie HSEC są cennym narzędziem do badania fizjologii i patofizjologii wątroby in vitro.

Nasza kolekcja komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby jest izolowana poprzez trawienie kolagenazą i selektywne pożywki do hodowli komórkowej. Nasze zamrożone komórki HSEC są kriokonserwowane pod koniec hodowli pierwotnej. Każda partia przechodzi testy pod kątem określonych markerów komórkowych i jest objęta gwarancją ≥70% żywotności po rozmrożeniu. W tym protokole pokazujemy, jak rozmrażać, umieszczać na płytkach i hodować pierwotne ludzkie komórki śródbłonka zatok wątrobowych.

Materiały do hodowli pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka 

• Normalne ludzkie sinusoidalne komórki śródbłonka (SEC)
  Uwaga: Po otrzymaniu natychmiast przechowywać kriofiolę (kriofiofile) w ciekłym azocie w fazie lotnej. 
• Kolagen typu I, ogon szczura
• Płytki wielodołkowe poddane działaniu kultury tkankowej
• Dulbecco's PBS, without Calcium & Magnesium (DPBS)
• Trypsin Solution
• Human Sinusoidal Endothelial Cell Maintenance Medium¹:

** Dostępne w Gibco.

Składniki	Numer katalogowy	Zapas roboczy	Końcowe rozcieńczenie	Końcowe stęż.	Objętość końcowa (mL)
Human Endothelial Medium	11111044**			1x	450
AB Human Serum	H3667-100ML	.		10%	50
Human VEGF	SRP3182-10UG	0.1mg/mL	10,000x	10ng/mL	0.05
Human HGF	H5791-10UG	0.1mg/mL	10,000x	10ng/mL	0.05
				Całkowita objętość	500

Metoda hodowli ludzkich komórek śródbłonka sinusoidalnego

Poniższe protokoły zostały wykonane przy użyciu biokomory z przepływem laminarnym klasy II i aspiratora. Wszystkie używane inkubatory były ustawione na 37°C i 5% CO₂. Przez cały czas należy nosić środki ochrony indywidualnej, w tym okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne i rękawiczki.

Protokół przygotowania płytek pokrytych kolagenem

1. Rozcieńczyć kolagen do końcowego stężenia 56 µg/ml w sterylnym 70% etanolu. Delikatnie wymieszaj roztwór, aż do całkowitego rozpuszczenia kolagenu.
2. Całkowicie pokryj dno studzienki mieszaniną kolagenu i etanolu.
3. Równomiernie pokryj wnętrze każdej studzienki mieszaniną kolagenu i etanolu, delikatnie przesuwając płytkę do hodowli komórkowej.
4. Pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym. Pozostawić płytkę do hodowli komórek na noc z uchyloną pokrywą, aby umożliwić przepływ powietrza i zapobiec kondensacji.

Rozmrażanie i umieszczanie ludzkich komórek śródbłonka zatok wątrobowych 

1. Odmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37˚C, trzymając ją i delikatnie obracając. Po rozmrożeniu wyjąć fiolkę z łaźni wodnej, wytrzeć do sucha, przepłukać 70% etanolem i przenieść na sterylne pole. Zdejmij nasadkę, nie dotykaj wewnętrznego gwintu palcami.
2. Przenieś zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Używając 5 ml pożywki, przepłucz fiolkę i przenieś do probówki stożkowej.
3. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 300 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić jej zawartość w pożywce.
4. Przelicz uzyskane komórki za pomocą licznika komórek, takiego jak Scepter 3.0 Handheld Automated Cell Counter.
5. W celu ekspansji, posiej HHSEC w gęstości 5000 komórek/cm² na płytkach pokrytych kolagenem I (patrz powyższy protokół).
6. W celu uzyskania najlepszych wyników, nie należy zakłócać hodowli HHSEC przez co najmniej 12 godzin po początkowym posianiu. Aby usunąć resztki DMSO lub niezamocowane komórki, zmień pożywkę wzrostową następnego dnia.
7. Kontynuuj zmianę pożywki co drugi dzień, aż będzie gotowa do użycia.

Podkulturowanie ludzkich komórek śródbłonka zatok wątrobowych 

1. Podkulturuj komórki, gdy osiągną 70-80% konfluencji. Konfluencję i zdrowie komórek można monitorować za pomocą Millicel^® DCI Digital Cell Imager.
2. Podgrzej pożywkę HHSEC, buforowaną sól fizjologiczną Dulbecco, bez wapnia i magnezu (DPBS) i 0,25% roztwór trypsyny do temperatury pokojowej.
3. Zasysaj pożywkę, a następnie przepłucz hodowlę HHSEC za pomocą DPBS. Dodaj roztwór trypsyny do kolby i umieść w inkubatorze w temperaturze 37°C na 3-5 minut lub do momentu całkowitego odłączenia się komórek.
4. Po odłączeniu się komórek, zbierz HHSEC z kolby hodowlanej z odpowiednią ilością pożywki.
5. Przenieś HHSEC do probówki wirówkowej i odwiruj przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
6. Po odwirowaniu odessać pożywkę, ponownie zawiesić osad i policzyć komórki do wysiewu.
7. Nasiać komórki do 5000 komórek/cm² na płytki pokryte kolagenem I (patrz powyższy protokół).

Referencje

1. Lalor PF, Edwards S, McNab G, Salmi M, Jalkanen S, Adams DH. 2002. Vascular Adhesion Protein-1 Mediates Adhesion and Transmigration of Lymphocytes on Human Hepatic Endothelial Cells. 169(2):983-992. https://doi.org/10.4049/jimmunol.169.2.983