Protokoły przyłączania kolagenu, rozpuszczalność i stabilność
Kolagen do hodowli komórkowych
Kolagen jest najobficiej występującym białkiem ssaków i jest głównym składnikiem tkanki łącznej i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W dwu- i trójwymiarowych hodowlach komórkowych naukowcy często wykorzystują białko kolagenowe do powlekania naczyń hodowlanych.
Typowo, kolagen jest najpierw syntetyzowany jako pojedyncze, bogate w glicynę monomeryczne nici pre-prokolagenu z rybosomów w szorstkim retikulum endoplazmatycznym (RER). Po przetransportowaniu do światła RER peptydy sygnałowe są rozszczepiane w celu uzyskania prokolagenu. Lizyna i prolina są hydroksylowane i glikozylowane w świetle i powstaje helisa złożona z trzech peptydów. Jest on następnie transportowany do Golgiego i wydalany z komórki przez egzocytozę. Propetydy prokolagenu są następnie usuwane, dając tropokolagen, który może łączyć się w fibryle. Oznaczenia "typu kolagenu" Bornsteina i Trauba są określane przez skład peptydowy potrójnej helisy.
Kolagen występuje jako kilka typów białek, z których najczęstszym jest typ I. Kolagen typu I występuje w kościach, ścięgnach, więzadłach, naczyniach krwionośnych, krążkach międzykręgowych, a Typ III, drugi pod względem liczebności typ kolagenu, często współwystępuje z typem I w skórze i naczyniach krwionośnych. Kolagen typu II jest głównym składnikiem białkowym chrząstki, Typ IV jest głównym składnikiem białkowym podstawy. jest głównym składnikiem białkowym blaszki podstawnej, a kolagen typu V jest związany z organizacją włókien kolagenowych i hamowaniem cyklu komórkowego nabłonka.
Ważne punkty do zapamiętania przed rozpoczęciem
- Upewnij się, że komórki są zdrowe i w odpowiedniej liczbie.
- Roztwory kolagenu mogą być sterylizowane przez dializę w 0,25% roztworze kwasu octowego i 0,5% roztworze chloroformu.
- Nie zalecamy sterylizacji roztworu kolagenu przez filtrację membranową. Stwierdziliśmy znaczną utratę białka w tej metodzie.
- Powlekanie plastikowych naczyń do hodowli tkankowych może być wykonywane przez suszenie na powietrzu. Wysuszone powlekane naczynia mogą być sterylizowane przez wystawienie na działanie światła UV w sterylnym okapie hodowlanym lub przez płukanie 70% etanolem.
- Stężenie pokrycia powierzchni może się różnić w zależności od hodowanych komórek. Optymalne warunki przyłączenia muszą być określone dla każdej linii komórkowej i aplikacji.
- Nie należy nadmiernie suszyć płytek hodowlanych / szkiełek nakrywkowych po pokryciu, ponieważ wpływa to na przyłączenie komórek.
- Wszystkie kroki w protokołach muszą być wykonywane w sterylnych warunkach.
Protokół powlekania kolagenem typu I dla naczyń hodowlanych
- Dodaj kolagen do kwasu octowego, aby uzyskać 0,1% (w/v) roztwór kolagenu. Mieszać w temperaturze pokojowej przez 1-3 godziny do rozpuszczenia. Roztwór kolagenu należy rozcieńczyć 10-krotnie, aby uzyskać stężenie robocze 0,01%.
- Zalecamy przeniesienie roztworu kolagenu do szklanej butelki z zakrętką i ostrożne ułożenie chloroformu na dnie. Ilość użytego chloroformu powinna wynosić około 10% objętości roztworu kolagenu. NIE WSTRZĄSAĆ ANI NIE MIESZAĆ. Odstawić na noc w chłodne miejsce. Aseptycznie usuń górną warstwę zawierającą roztwór kolagenu.
- Pokryj naczynia i pozwól białku wiązać się przez kilka godzin w temperaturze pokojowej, 37 °C lub przez noc w temperaturze 2-8 °C.
- Usuń nadmiar płynu z pokrytej powierzchni i pozwól mu wyschnąć przez noc.
- Jeśli roztwór kolagenu nie jest sterylny, wysuszoną, powleczoną powierzchnię można wysterylizować przez całonocną ekspozycję na światło UV w sterylnym okapie do hodowli tkankowych.
- Przed wprowadzeniem komórek i pożywki przepłukać sterylną wodą do hodowli tkankowych lub zrównoważonym roztworem soli.
Rysunek 1. Struktura białka kolagenu typu I.
Protokół powlekania kolagenem typu II i IV naczyń hodowlanych
- Kolagen typu II i IV można odtworzyć do stężenia 0,5-2,0 mg/ml w kwasie octowym. Rozpuszczać przez kilka godzin w temperaturze 2-8°C, od czasu do czasu mieszając.
- Pokryć plastikowe naczynia do hodowli tkankowych poprzez suszenie na powietrzu. Alternatywnie, wstępnie inkubować pokryte naczynia hodowlane przez noc w temperaturze 2-8 °C (lub kilka godzin w temperaturze 37 °C).
- Wysuszone pokryte naczynia mogą być sterylizowane przez wystawienie na działanie światła UV w sterylnym okapie hodowlanym lub przez płukanie 70% etanolem.
Rysunek 2.A. Struktura białka kolagenu typu II, głównie trzy nici. B. Struktura białkowa kolagenu typu IV, głównie dwuniciowa. C. Struktura białkowa kolagenu typu IV, z przewagą jednej nici.
Kolagen typu I
Kolagen typu IV
Inne kolageny: Typ II, Typ III, Typ I i III, Typ I i IV oraz Typ V
Dlaczego w roztworze kolagenu widzę nierozpuszczalne cząsteczki?
Specyfikacja rozpuszczalności niektórych produktów kolagenowych, takich jak C7661, jest klarownym do mętnego bezbarwnym roztworem z kilkoma nierozpuszczalnikami w stężeniu 1 mg/ml w wodzie z 2 μL kwasu octowego (lub 0,1 N kwasu octowego). Nierozpuszczalniki można usunąć przez osadzenie lub odwirowanie.
Produkt zżelował podczas przechowywania w lodówce. Czy można go nadal używać?
To może się zdarzyć, ale nie szkodzi produktowi. Po ogrzaniu do temperatury pokojowej produkt upłynni się. Upewnij się, że jest dobrze wymieszany przed rozcieńczeniem w celu pokrycia naczyń hodowlanych.
Czy wszystkie produkty kolagenowe mogą być używane do tworzenia trójwymiarowych żeli kolagenowych?
Nie, nie wszystkie produkty kolagenowe mogą tworzyć żele lub być stosowane w aplikacjach 3D. Przydatność zależy od typu kolagenu, stężenia i konkretnego składu. Sprawdź specyfikacje produktu w tabelach powyżej, aby upewnić się, że spełnia on wymagania dotyczące tworzenia żelu i zastosowań 3D.
Jak długo można przechowywać płytki pokryte kolagenem?
Nie udzielamy żadnych zaleceń dotyczących przechowywania płyt po powlekaniu. Ponieważ kilka czynników, takich jak wilgotność, może mieć wpływ na trwałość powlekanych płyt, klienci powinni samodzielnie określić, czy płyty mogą być przechowywane i w jakich warunkach. Produkt nie powinien być wystawiany na działanie temperatur powyżej 50 °C.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?