Ficoll^® 400 do wirowania gradientowego

Nr produktu. F4375

CAS #: 26873-85-8

Ficoll^® 400 jest wysoce rozgałęzionym polimerem powstałym w wyniku kopolimeryzacji sacharozy i epichlorohydryny. Ficoll^® 400 jest całkowicie niejonowy. Ze względu na dużą ilość grup hydroksylowych, Ficoll^® 400 jest bardzo hydrofilowy i wyjątkowo rozpuszczalny w wodzie. Najczęstszym zastosowaniem Ficoll^® 400 jest pożywka o gradiencie gęstości do separacji i izolacji komórek eukariotycznych, organelli i komórek bakteryjnych. Można uzyskać zakres gęstości do 1,2 g/ml.

Właściwości fizyczne

Wygląd: Biały do białego ze słabym żółtym proszkiem

Straty podczas suszenia: Nie więcej niż 5%¹

Ciężar cząsteczkowy: 400 000 +/- 100 000, jak określono na podstawie lepkości wewnętrznej¹

Specyficzna rotacja: +56.5° at 20 °C (C=1% in water)¹                                       

Lepkość wewnętrzna: ok. 0.17 dl/g¹

Dializowalny materiał, w tym NaCl: mniej niż 1%¹

Promień Stokesa: około 10 nm¹

W przeciwieństwie do sacharozy, roztwory Ficollu mają stosunkowo niską osmolalność. Mimo to gęstość Ficoll w roztworach wodnych jest porównywalna z gęstością sacharozy.

Z powodu wysokiej masy cząsteczkowej i niskiej zawartości materiału dializowalnego, Ficoll ma znacznie niższą przepuszczalność w stosunku do błon komórkowych niż sacharoza. Dlatego można oczekiwać, że komórki będą gromadzić się w gradientach Ficoll z mniejszą gęstością niż w gradientach sacharozy. Ze względu na niską przepuszczalność błon i niskie ciśnienie osmotyczne, separacja w Ficoll zwykle skutkuje lepszym zachowaniem funkcji i morfologii komórek.

Przechowywanie/Stabilność

Przechowywany prawidłowo jako proszek w temperaturze pokojowej Ficoll 400 może mieć okres trwałości 5 lat.

Rozpuszczalność/stabilność roztworu

Stężenia 50% (w/v) można osiągnąć w wodzie. Ficoll powinien być dodawany powoli przy ciągłym mieszaniu.

Testujemy rozpuszczalność Ficoll 400 przy 1 g w 10 ml wody dejonizowanej, uzyskując klarowny do lekko mętnego, bezbarwny do słabo żółtego roztwór. 

Ficoll jest stabilny w roztworach alkalicznych i obojętnych. Przy wartościach pH poniżej 3 ulega szybkiej hydrolizie, szczególnie w podwyższonych temperaturach. 

Ficoll można sterylizować w autoklawie przy neutralnym pH, w temperaturze 110 °C przez 30 minut. 

Należy unikać silnych środków utleniających i redukujących.

Procedura

Wirowanie

Ficoll^® 400 może być stosowany do wirowania gradientowego we wszystkich typach rotorów wirówek i do separacji przy jednostkowej grawitacji. W przypadku wirowania możliwe są zarówno gradienty nieciągłe, jak i ciągłe. Gradienty nieciągłe mają dwie główne zalety: Po pierwsze, nagłe zmiany gęstości Ficoll 400 oznaczają, że wyizolowane komórki znajdują się w ostrych pasmach na styku warstw o różnej gęstości. Pozwala to na łatwe usunięcie próbki za pomocą pipety. Po drugie, komórki o dużych różnicach gęstości można łatwo wyizolować za pomocą zaledwie dwóch warstw gęstości. Osiąga się to poprzez wybór gęstości, które zapobiegną przedostawaniu się jednego lub więcej typów komórek do niższej fazy, pasmując te typy komórek na granicy faz.

Aby oszacować gęstości wymagane dla konkretnego zastosowania, zapoznaj się z poniższą tabelą:

Źródło	Gęstość wyporu	Warunki
Membrany	1.05	100,000xg przez 16 godzin
Chromatofory	1.07	195,000xg przez 36 godzin
Hepatocyty	1.10-1,15	6,000xg przez 2 godziny
Fibroblasty	1.05	8,000xg przez 1 godzinę
Komórki wodobrzusza Ehrlicha	1.07	1,400xg przez 45 min

Rysunek 1. Poniżej przedstawiono wykres gęstości Ficoll w funkcji stężenia.

Przygotowanie nieciągłego gradientu:

1. Przygotuj Ficoll 400 w buforze lub izotonicznym roztworze sacharozy (0,25M) w stężeniach, które powinny oddzielić interesujący materiał. Większość komórek i organelli ma gęstość wyporu między 1,0 a 1,2 g/ml w Ficoll 400.  Często wystarczający jest gradient dwuwarstwowy. Roztwory wykonane na tym etapie mogą być przechowywane w lodówce, ale powinny być używane w temperaturze pokojowej.
   
2. W standardowych probówkach wirówkowych utwórz warstwy (o głębokości około 1 cm) z najgęstszą warstwą na dnie.
   
3. Uważając, aby nie mieszać warstw gradientu, ostrożnie ułóż próbkę na wierzchu. Delikatnie wymieszaj próbkę i najwyższą warstwę Ficoll 400 za pomocą szklanego pręcika, aby wyeliminować interfejs przed wirowaniem.

Podczas wirowania różne cząstki będą gromadzić się w warstwach Ficoll lub między nimi, w zależności od ich gęstości. Po zakończeniu wirowania należy odessać pipetą różne fazy i usunąć Ficoll z interesujących nas frakcji. Ficoll może być usunięty z wyizolowanych komórek i organelli poprzez powtarzane cykle rozcieńczania buforem, a następnie wirowanie. Resztkowe ilości Ficoll 400 w próbce można oszacować za pomocą reakcji antronowej.²

W niektórych przypadkach może być pożądany ciągły lub liniowy gradient gęstości. Można go łatwo przygotować przy użyciu mieszalnika gradientowego. Do prostych separacji można użyć homologicznego roztworu Ficoll 400 bez gradientu.  Frakcjonowanie odbywa się poprzez stopniowe zwiększanie prędkości wirowania. Ficoll był również stosowany w badaniach wirowania strefowego.³

Sedymentacja grawitacyjna przez gradient gęstości jest szeroko stosowana do oddzielania komórek wrażliwych na wirowanie. Komórki o podobnej gęstości, ale różnej wielkości mogą być również skutecznie oddzielane przy jednostkowej grawitacji.^4,5,6

Podłoża gęstości Ficoll-Hypaque (Histopaque)

W zastosowaniach wymagających Ficoll-Hypaque stosuje się mieszaninę Ficoll i diatrizoatu sodu. Oferujemy wstępnie uformowane mieszaniny o trzech różnych gęstościach pod nazwami produktów Histopaque-1077. 1083, oraz 1119.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Ficoll 400 jest składnikiem roztworu Denhardta stosowanego w analizie Northern i Southern blot. Ficoll zmniejsza niespecyficzne wiązanie materiału z membranami nitrocelulozowymi podczas hybrydyzacji kwasów nukleinowych.⁷

Oferujemy roztwór Denhardta (numer produktu D2532), koncentrat 50X, przetestowany do stosowania w hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Typowe roztwory do hybrydyzacji wymagają 5-krotnego stężenia roztworu Denhardta.

Zastosowania immunologiczne

Ficoll 400 został zastosowany jako nośnik haptenów i został sprzężony z dinitrofenolem, trinitrofenolem i fluoresceinizotiocyjanianem w celu wzmocnienia pierwotnej odpowiedzi immunologicznej u myszy. Koniugaty o różnych poziomach podstawienia i minimalnej toksyczności są łatwe do przygotowania.^8,9

Chemicznie zdefiniowane pożywki do hodowli komórkowych

Ficoll jest stosowany z i bez czynników wzrostu pochodzących z surowicy w celu wspierania wzrostu zarówno pierwotnych kultur, jak i ustalonych linii komórkowych.^10,11

Dializa koncentracyjna

Ficoll 400 jest przydatny do zatężania roztworów za pomocą dializy, ponieważ jego wysoka masa cząsteczkowa uniemożliwia mu przejście przez błonę dializacyjną. Ciśnienie osmotyczne wciąga wodę przez membranę do roztworu Ficoll 400, skutecznie zagęszczając wrażliwe materiały.¹

Elektroforeza

Elektroforeza w przepływie ciągłym zwykle wymaga stabilizatora w elektrolicie. Ficoll 400 jest często używany do tego zastosowania.^12,13

Podział fazowy

Podział fazowy oddziela komórki na podstawie właściwości powierzchni. Ficoll 400 jest łączony z glikolem polietylenowym w układach dwufazowych oraz z dekstranem i glikolem polietylenowym w układach trójfazowych.^14,15

Fizjologiczne roztwory do perfuzji i stabilizacji komórek

Ficoll został dodany do perfuzatu soli fizjologicznej podczas monitorowania wydalania białka w naczyniach. Witryfikowane zarodki myszy rozcieńczono roztworami zawierającymi 30% Ficoll plus 0,5 M sacharozy.¹⁷ Izolowane nerki szczurów perfundowano roztworem Tyrode'a zawierającym 4,7% Ficoll 400.¹⁸

*Ficoll jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Pharmacia. Informacje na temat właściwości fizycznych i zastosowań uzyskano od firmy Pharmacia.

*Ficoll jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Pharmacia.

Referencje

1. Supplier Data.

2. Scott TA, Melvin EH. 1953. Determination of Dextran with Anthrone. Anal. Chem.. 25(11):1656-1661. https://doi.org/10.1021/ac60083a023

3. Lavrenko PN, Mikriukova OI, Okatova OV. 1987. On the separation ability of various ficoll gradient solutions in zonal centrifugation. Analytical Biochemistry. 166(2):287-297. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90577-x

4. Tulp A, Bont W. 1975. An improved method for the separation of cells by sedimentation at unit gravity. Analytical Biochemistry. 67(1):11-21. https://doi.org/10.1016/0003-2697(75)90267-5

5. Bont WS, De Vries JE, Geel M, Van Dongen A, Loos HA. 1979. Separation of human lymphocytes and monocytes by velocity sedimentation at unit gravity. Journal of Immunological Methods. 29(1):1-16. https://doi.org/10.1016/0022-1759(79)90120-0

6. Niskanen E, Wells JR, Golde DW, Cline MJ. 1985. Separation By Velocity Sedimentation of Human Haemopoietic Precursors Forming Colonies in vivo and in vitro Cultures. Cell Prolif. 18(4):399-406. https://doi.org/10.1111/j.1365-2184.1985.tb00670.x

7. Sambrook J. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. p. 9.48 - 50, B.15. Cold Spring Harbor Laboratory.

8. McMaster PR, Owens JD, Vannier WE. 1977. The preparation and characterization of a thymic independent antigen: ?-dinitrophenyl-L-lysine-ficoll. Immunochemistry. 14(3):189-196. https://doi.org/10.1016/0019-2791(77)90193-8

9. Inman JK. 1975. Thymus-independent antigens: the preparation of covalent, hapten-ficoll conjugates. J. Immunol. 114704.

10. Clark J, Fisher G, Wieser RJ. 1983. Hormonally Defined Media, Lecture Posters, Eur. Conf. Serum-Free Cell Culture. Berlin: Springer.

11. Kao K. 1981. Plant Formation from Barley Anther Cultures with Ficoll Media. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 103(5):437-443. https://doi.org/10.1016/s0044-328x(81)80166-3

12. Platsoucas CD, Catsimpoolas N. 1980. Density gradient electrophoresis of mouse spleen lymphocytes: Age-related differences. A critical thymus-dependent event during development in the young adult mouse. Journal of Immunological Methods. 34(1):31-41. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90221-5

13. Platsoucas CD, Good RA, Gupta S. 1980. Separation of human lymphocyte subpopulations by density gradient electrophoresis. Cellular Immunology. 51(2):238-249. https://doi.org/10.1016/0008-8749(80)90256-7

14. Johansson G, Joelsson M. 1991. Partition of hydrophobic compounds between two liquid phases of similar hydrophobicity. Journal of Chromatography A. 46449-59. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(00)94222-5

15. Albertsson P, Birkenmeier G. 1988. Affinity separation of proteins in aqueous three-phase systems. Analytical Biochemistry. 175(1):154-161. https://doi.org/10.1016/0003-2697(88)90373-9

16. Nolly H, Nolly A. 1998. Release of endothelial-derived kallikrein, kininogen and kinins. Biol. Res. 31(3)169-174.

17. Mukaida T, Wada S, Takahashi K, Pedro P, An T, Kasai M. 1998. Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8-cell mouse embryos. Human Reproduction. 13(10):2874-2879. https://doi.org/10.1093/humrep/13.10.2874

18. Barthelmebs M, Loichot C, Nisato D, de Jong W, Grima M, Imbs JL. 1998. [Modulation by nitric oxide of vasopressin induced renal vasoconstriction varies with perfusate viscosity in the isolated rat kidney]. Arch. Mal. Coeur. Vaiss. 91(8):

19. Hong YH, Moon Y, Jeong DK, Han JY. 1998. Improved Transfection Efficiency of Chicken Gonadal Primordial Germ Cells for the Production of Transgenic Poultry. Transgenic Res.(7):247–252.

20. Atawodi SE, Lea S, Nyberg F, Mukeria A, Constantinescu V, Ahrens W, Brueske-Hohlfeld I, Fortes C, Boffetta P, Friesen MD. 1998. 4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanone-hemoglobin adducts as biomarkers of exposure to tobacco smoke: validation of a method to be used in multicenter studies. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 7817.

21. Oosterwijk JC. 1998. Prenatal diagnosis of trisomy 13 on fetal cells obtained from maternal blood after minor enrichment. Prenat. Diagn. 181082.

22. Krackhardt A. 1989. Exp. Hematol. 261265.

23. Woods JA, Evans JK, Wolters BW, Ceddia MA, McAuley E. 1998. Effects of Maximal Exercise on Natural Killer (NK) Cell Cytotoxicity and Responsiveness to Interferon-  in the Young and Old. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A(6):B430-B437. https://doi.org/10.1093/gerona/53a.6.b430

24. Schlenke P, Klu?ter H, Mu?ller-Steinhardt M, Hammers H, Borchert K, Bein G. 1998. Evaluation of a Novel Mononuclear Cell Isolation Procedure for Serological HLA Typing. Clin. Diagn. Lab. Immunol.. 5(6):808-813. https://doi.org/10.1128/cdli.5.6.808-813.1998

25. Hull DR, Corr BR, Markey GM, Alexander HD, Morris TC. 1998. Familiality of monocyte esterase deficiency in patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis. Renal Failure. 20(4):607-612. https://doi.org/10.3109/08860229809045153

26. Krieger K, Klimke A, Henning U. 1998. Active [3H]-Dopamine Uptake Displayed by Native Lymphocyte Suspensions is Mainly Due to Contaminating Platelets. Pharmacopsychiatry. 31(05):193-198. https://doi.org/10.1055/s-2007-979326

27. Brandhorst H, Brandhorst D, Brendel MD, Hering BJ, Bretzel RG. 1998. Assessment of Intracellular Insulin Content during All Steps of Human Islet Isolation Procedure. Cell Transplant. 7(5):489-495. https://doi.org/10.1177/096368979800700508

28. Lakey JR, Cavanagh TJ, Zieger MA. 1998. A Prospective Comparison of Discontinuous Euroficoll and Eurodextran Gradients for Islet Purification. Cell Transplant. 7(5):479-487. https://doi.org/10.1177/096368979800700507

29. Vida TA, Graham TR, Emr SD. 1990. In vitro reconstitution of intercompartmental protein transport to the yeast vacuole.. 111(6):2871-2884. https://doi.org/10.1083/jcb.111.6.2871

30. Yemul S, Berger C, Estabrook A, Suarez S, Edelson R, Bayley H. 1987. Selective killing of T lymphocytes by phototoxic liposomes.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84(1):246-250. https://doi.org/10.1073/pnas.84.1.246

31. Schneider E, Lepault F, Guy-Grand D, Minkowski M, Dy M, Immunol J. 1987. Histamine-producing cell-stimulating activity. Interleukin 3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induce de novo synthesis of histidine decarboxylase in hemopoietic progenitor cells. 1393710.

32. Volloch V, Schweitzer B, Rits S. 1987. Synthesis of globin RNA in enucleated differentiating murine erythroleukemia cells.. 105(1):137-143. https://doi.org/10.1083/jcb.105.1.137