Protokół hodowli ludzkich melanocytów naskórkowych (HEM)

I. Przechowywanie
II. Przygotowanie do hodowli
III. Hodowla HEM
IV. Podhodowla HEM
Produkty

I. Przechowywanie

A. Fiolki kriokonserwowane (104-05a, 104-05n)

Przechowywać fiolki kriokonserwowane w zbiorniku z ciekłym azotem natychmiast po ich dostarczeniu.

*Podczas wyjmowania fiolek kriokonserwowanych ze zbiornika z ciekłym azotem należy nosić maseczkę ochronną i rękawiczki. Gwałtowna zmiana temperatury ze zbiornika do pomieszczenia może spowodować, że uwięziony w fiolkach ciekły azot pęknie i spowoduje obrażenia.

II. Przygotowanie do hodowli

1. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego klasy II, z laminarnym przepływem powietrza filtrowanym przez filtr HEPA, jest w odpowiednim stanie technicznym.
2. Sterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% alkoholem.
3. Włącz dmuchawę szafki bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed rozpoczęciem hodowli komórek.
4. Upewnij się, że wszystkie pipety serologiczne, końcówki do pipet i roztwory odczynników są sterylne.
5. Przestrzegaj standardowej techniki sterylizacji i zasad bezpieczeństwa:
   a. Nie pipetować doustnie.
   b. Podczas pracy z ludzkimi komórkami należy zawsze nosić rękawiczki i okulary ochronne, nawet jeśli wszystkie szczepy zostały przebadane na obecność wirusa HIV, zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu C.
   c. Wszystkie prace związane z hodowlą komórek należy wykonywać w sterylnym pomieszczeniu.

III. Hodowla HEM

A. Przygotowanie kolb hodowlanych do hodowli HEM

1. Wyjmij Melanocyte Growth Medium z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym pomieszczeniu.
2. Odmierzyć pipetą 15 ml pożywki do hodowli melanocytów* do kolby T-75.

*Zachować stosunek pożywki do powierzchni na poziomie 1 ml na 5 cm².

Na przykład:

5 ml dla kolby T-25 lub szalki do hodowli tkanek o średnicy 60 mm.
15 ml dla kolby T-75 lub naczynia do hodowli tkanek o średnicy 100 mm.

B. Rozmrażanie i umieszczanie HEM

1. Wyjmij kriokonserwowaną fiolkę HEM ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu, stosując odpowiednią ochronę oczu i rąk.
2. Obróć korek fiolki o ćwierć obrotu, aby uwolnić ciekły azot, który może być uwięziony w gwintach, a następnie ponownie dokręć korek.
3. Szybko rozmroź komórki, umieszczając dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i uważnie obserwuj fiolkę podczas procesu rozmrażania.
4. Wyjmij fiolkę z łaźni wodnej, gdy w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu. Nie pozwól na całkowite rozmrożenie komórek.
5. Odkaż zewnętrzną część fiolki 70% alkoholem w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Usuń ostrożnie korek fiolki. Nie dotykaj brzegu nakrętki ani fiolki rękami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Zawieś ponownie komórki w fiolce, delikatnie pipetując komórki 5 razy pipetą o pojemności 2 ml. Należy uważać, aby nie pipetować zbyt energicznie, aby nie spowodować pienienia.
8. Wprowadź pipetą zawiesinę komórek (1 ml) z fiolki do kolby T-75 zawierającej 15 ml pożywki do wzrostu melanocytów.
9. Zamknąć kolbę i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
10. Umieścić kolbę T-75 w 37°C, 5% CO₂ w nawilżanym inkubatorze. Poluzuj korek, aby umożliwić wymianę gazową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie należy zakłócać hodowli przez 24 godziny po inokulacji.
11. Zmień na świeżą pożywkę do wzrostu melanocytów po 24 godzinach lub przez noc, aby usunąć wszystkie ślady DMSO.
12. Zmieniaj pożywkę do wzrostu melanocytów co drugi dzień, aż komórki osiągną 60% konfluencji.
13. Podwoić objętość pożywki do wzrostu melanocytów, gdy hodowla osiągnie 60% konfluencji lub w przypadku karmienia weekendowego.
14. Podkulturuj komórki, gdy hodowla HEM osiągnie 80% konfluencji.

IV. Podhodowla HEM

A. Przygotowanie odczynników do podhodowli

1. Wyjmij roztwór trypsyny-EDTA i inhibitor trypsyny z zamrażarki o temperaturze -20°C i rozmroź przez noc w lodówce.
2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki do podhodowli są rozmrożone. Delikatnie zawiruj każdą butelkę kilka razy, aby utworzyć jednorodne roztwory.
3. Przechowuj wszystkie odczynniki do podhodowli w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
4. Odmierz roztwór trypsyny/EDTA i przechowuj niewykorzystaną część w temperaturze -20 °C, jeśli potrzebna jest tylko część trypsyny/EDTA 

B. Przygotowanie kolby hodowlanej

1. Wyjmij Melanocyte Growth Medium z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym pomieszczeniu.
2. Odmierzyć pipetą 30 ml pożywki do hodowli melanocytów do kolby T-175 (do użycia w sekcji IV C, krok 15.)

C. Subkultura Hem

Trypsynować komórki w temperaturze pokojowej. Nie podgrzewaj żadnych odczynników do 37°C.

1. Usuń pożywkę z kolb hodowlanych przez aspirację.
2. Umyj monowarstwę komórek za pomocą HBSS i usuń roztwór przez aspirację.
3. Nanieś pipetą 5 ml roztworu trypsyny/EDTA do kolby T-75. Delikatnie potrząśnij kolbą, aby upewnić się, że roztwór pokrywa wszystkie komórki.
4. Natychmiast usuń 4 ml roztworu.
5. Zamknij szczelnie kolbę i monitoruj postęp trypsynizacji w temperaturze pokojowej pod odwróconym mikroskopem. Zaokrąglenie komórek zajmuje zwykle około 2 do 4 minut. Komórki mogą nie stać się całkowicie okrągłe podczas trypsynizacji, a niektóre komórki mogą zachować pewne procesy, nawet jeśli zostaną oderwane od powierzchni hodowli.
6. Uwolnij zaokrąglone komórki z powierzchni hodowli, uderzając bokiem kolby o dłoń, aż większość komórek zostanie odłączona.
7. Nanieś pipetą 5 ml roztworu inhibitora trypsyny do kolby, aby zahamować dalszą aktywność tryptyczną.
8. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
9. Przepłucz kolbę dodatkowymi 5 ml roztworu inhibitora trypsyny i przenieś roztwór do tej samej probówki stożkowej.
10. Zbadaj kolbę T-75 pod mikroskopem. Jeśli w kolbie pozostało 20% komórek, powtórz kroki 2-9.
11. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 220 x g przez 5 minut, aby osuszyć komórki.
12. Odessaj supernatant z probówki bez naruszania osadu komórek.
13. Przesuń końcówkę stożkowej probówki palcem, aby poluzować osad komórek.
14. Zawieś ponownie komórki w 5 ml pożywki do wzrostu melanocytów , delikatnie pipetując komórki, aby rozbić grudki.
15. Przelicz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zaszczepić 10 000 komórek na cm² dla szybkiego wzrostu lub 6 000 komórek na cm² dla regularnych subkultur.

.