Linia ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Storage

Preparation for Culturing

Hodowla HBEpC

Subculturing HBEpC

Materiały.

I. Przechowywanie

A. Fiolki kriokonserwowane (502-05a)

Przechowywać fiolki kriokonserwowane w zbiorniku z ciekłym azotem natychmiast po dostarczeniu.

*Podczas wyjmowania fiolek ze zbiornika z ciekłym azotem należy nosić maskę ochronną i rękawice. Gwałtowna zmiana temperatury między zbiornikiem a pomieszczeniem może spowodować pęknięcie uwięzionego w fiolkach ciekłego azotu i obrażenia.

Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (HBEpC)

II. Przygotowanie do hodowli

1. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego klasy II, z laminarnym przepływem powietrza filtrowanym HEPA, jest w odpowiednim stanie technicznym.
2. Sterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% alkoholem.
3. Włącz dmuchawę szafki bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed rozpoczęciem pracy z kulturami komórkowymi.
4. Upewnij się, że wszystkie pipety serologiczne, końcówki do pipet i roztwory odczynników są sterylne.
5. Przestrzegaj standardowej techniki sterylizacji i zasad bezpieczeństwa:
   a. Nie pipetować doustnie.
   b. Zawsze noś rękawice i okulary ochronne podczas pracy z ludzkimi komórkami, nawet jeśli wszystkie szczepy zostały przebadane na obecność wirusa HIV, zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu C.
   c. Wszystkie prace związane z hodowlą komórek należy wykonywać w sterylnym pomieszczeniu.

III. Hodowla HBEpC

A. Przygotowanie kolb do hodowli komórkowej HBEpC

1. Pobrać z Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium (511-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Pipeta 15 ml Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium (511-500)* do kolby T-75  (SIAL0641).
   * Stosunek pożywki do powierzchni powinien wynosić 1 ml na 5 cm².
   Na przykład:
   -  5 mL dla kolby T-25 (SIAL0639) lub 60 mm naczynie do hodowli tkanek  (SIAL0166).
   -  15 ml dla kolby T-75  (SIAL0641) lub 100 mm naczynie do hodowli tkankowej  (SIAL0167).

B. Rozmrażanie i powlekanie HBEpC

1. Wyjmij kriokonserwowaną fiolkę HBEpC ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu, stosując odpowiednią ochronę oczu i rąk.
2. Obróć nakrętkę fiolki o ćwierć obrotu, aby uwolnić ciekły azot, który może być uwięziony w gwintach, a następnie ponownie dokręć nakrętkę.
3. Szybko rozmroź komórki, umieszczając dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i uważnie obserwuj fiolkę podczas procesu rozmrażania.
4. Wyjmij fiolkę z łaźni wodnej, gdy w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu.Nie dopuścić do całkowitego rozmrożenia komórek.
5. Odkazić zewnętrzną powierzchnię fiolki 70% alkoholem w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Ostrożnie zdjąć korek fiolki. Nie dotykaj brzegu nakrętki ani fiolki rękami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Zawieś ponownie komórki w fiolce, delikatnie pipetując komórki 5 razy pipetą o pojemności 2 ml. Należy uważać, aby nie pipetować zbyt energicznie, aby nie spowodować pienienia.
8. Przeprowadź pipetą zawiesinę komórek (1 ml) z fiolki do kolby T-75 (kolby T-75  (kolby T-75).SIAL0641) zawierającej 15 mL pożywki do wzrostu nabłonka oskrzeli i tchawicy  (511-500).
9. Zamknąć kolbę i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
10. Umieść kolbę T-75  (SIAL0641) w 37 ^oC, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze. Poluzuj pokrywę, aby umożliwić wymianę gazową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie należy zakłócać hodowli przez 24 godziny po zaszczepieniu.
11. Zmień na świeżą pożywkę Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium  (511-500) po 24 godzinach lub na noc, aby usunąć wszystkie ślady DMSO.
12. Zmieniaj pożywkę Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium  (511-500) co drugi dzień, aż komórki osiągną 45% konfluencji.
13. Podwoić ilość pożywki Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium (511-500) objętość, gdy hodowla jest >45% konfluentna lub do karmienia weekendowego.
14. Poddaj komórki subkulturze, gdy hodowla HBEpC osiągnie 60-80% konfluencji.

IV. Podhodowla HBEpC

A. Przygotowanie odczynników do podhodowli

1. Usuń roztwór trypsyny-EDTA (roztwór trypsyny-EDTA) i usuń z płynnego roztworu T3924.T3924) i inhibitor trypsyny (T6414) z zamrażarki -20 °C i rozmrozić przez noc w lodówce.
2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki do podhodowli są rozmrożone. Delikatnie zawiruj każdą butelkę kilka razy, aby utworzyć jednorodne roztwory.
3. Przechowuj wszystkie odczynniki do podhodowli w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
4. Aliquot Roztwór trypsyny/EDTA  (T3924) i przechowuj niewykorzystaną część.) i przechowywać niewykorzystaną część w temperaturze -20 °C, jeśli potrzebna jest tylko część roztworu  Trypsin/EDTA (T3924).

B. Przygotowanie kolby hodowlanej

1. Pobrać z  kolby hodowlanej.Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium  (511-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Odmierzyć pipetą 30 ml Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium (511-500) do kolby T-175  (SIAL1080) (do użycia w Sekcji IV C Krok 15.).)

C. Subkultura HBEpC

Trypsynować komórki w temperaturze pokojowej. Nie podgrzewać żadnych odczynników do 37 °C.

1. Usuń pożywkę z kolb hodowlanych przez aspirację.
2. Umyć monowarstwę komórek za pomocą HBSS  (H6648) i usunąć roztwór przez aspirację.
3. Nanieść pipetą 8 ml roztworu trypsyny/EDTA () do probówki.T3924) do kolby T-75  (SIAL0641). Delikatnie potrząśnij kolbą, aby upewnić się, że roztwór pokrywa wszystkie komórki.
4. Zamknij szczelnie kolbę i monitoruj postęp trypsynizacji w temperaturze pokojowej pod odwróconym mikroskopem. Wykonuj tę czynność przez 60 sekund.
5. Ataksuj Roztwór trypsyny/EDTA  (T3924).
6. Zamknąć kolbę i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37°C na 1,5 minuty.
7. Uwolnij zaokrąglone komórki z powierzchni hodowli, uderzając bokiem kolby o dłoń, aż większość komórek zostanie odłączona.
8. Jeśli komórki nie zostaną wizualnie odłączone, umieść kolbę w inkubatorze na dodatkowe trzydzieści sekund, a następnie powtórz krok 7.
9. Dozuj 5 ml  Inhibitora trypsyny  (T6414) do kolby, aby zahamować dalszą aktywność trypsyny.
10. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
11. Przepłucz kolbę dodatkowymi 5 ml  inhibitora trypsyny  (T6414) i przenieś roztwór do tej samej probówki stożkowej.
12. Zbadaj kolbę T-75  (SIAL0641) pod mikroskopem. Jeśli w kolbie pozostało >20% komórek, powtórz kroki 2-9.
13. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 220 x g przez 5 minut, aby osuszyć komórki.
14. Spuść supernatant z probówki bez naruszania osadu komórek.
15. Przesuń palcem końcówkę probówki stożkowej, aby poluzować osad komórek.
16. Zawieś ponownie komórki w 2 ml pożywki Bronchial/Tracheal Epithelial Growth Medium  (511-500), delikatnie pipetując komórki w celu rozbicia grudek.
17. Zlicz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zaszczepić 7 500 komórek na cm² w przypadku szybkiego wzrostu lub 5 000 komórek na cm² w przypadku regularnych subkultur.

.