Protokół hodowli ludzkich keratynocytów naskórkowych (HEK)

Storage
Preparation for Culturing
Kultura HEK
Subkultura HEK

I. Przechowywanie

A. Fiolki kriokonserwowane (102-05n, 102-05f, 102-05a)

Przechowywać fiolki kriokonserwowane w zbiorniku z ciekłym azotem natychmiast po ich dostarczeniu.

*Podczas wyjmowania fiolek kriokonserwowanych ze zbiornika z ciekłym azotem należy nosić maseczkę ochronną i rękawiczki. Gwałtowna zmiana temperatury między zbiornikiem a pomieszczeniem może spowodować pęknięcie uwięzionego w fiolkach ciekłego azotu i obrażenia.

Rysunek 1. Ludzkie keratynocyty naskórkowe (HEK)

II. Przygotowanie do hodowli

1. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego klasy II z laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA jest w odpowiednim stanie technicznym.
2. Sterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% alkoholem.
3. Włącz dmuchawę szafki bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed rozpoczęciem pracy z hodowlą komórkową.
4. Upewnij się, że wszystkie pipety serologiczne, końcówki do pipet i roztwory odczynników są sterylne.
5. Przestrzegaj standardowej techniki sterylizacji i zasad bezpieczeństwa:
   a. Nie pipetować doustnie.
   b. Podczas pracy z ludzkimi komórkami należy zawsze nosić rękawice i okulary ochronne, nawet jeśli wszystkie szczepy zostały przebadane na obecność wirusa HIV, zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu C.
   c. Wszystkie prace związane z hodowlą komórek należy wykonywać w sterylnym pomieszczeniu.

III. Hodowla HEK

A. Przygotowanie kolb do hodowli komórek HEK

1. Wyjmij z lodówki Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500)*. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym okapie.
2. Odmierzyć pipetą 15 ml Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500)** do kolby T-75.
   * Użyj Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for adult cells (131-500a) do wszystkich etapów tej procedury, jeśli pracujesz z 306-05a, Human Epidermal Keratinocytes, HEK, adult (106-05a).
   ** Stosunek pożywki do powierzchni powinien wynosić 1 ml na 5 cm².
   Na przykład:
   -  5 ml na kolbę T-25 lub szalkę do hodowli tkanek o średnicy 60 mm.
   -  15 ml dla kolby T-75 lub naczynia do hodowli tkanek o średnicy 100 mm (SIAL0167).

B. Rozmrażanie i umieszczanie HEK

1. Wyjmij kriokonserwowaną fiolkę HEK ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu, stosując odpowiednią ochronę oczu i rąk.
2. Obróć nakrętkę fiolki o ćwierć obrotu, aby uwolnić ciekły azot, który może być uwięziony w gwintach, a następnie ponownie dokręć nakrętkę.
3. Szybko rozmroź komórki, umieszczając dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i uważnie obserwuj fiolkę podczas procesu rozmrażania.
4. Wyjmij fiolkę z łaźni wodnej, gdy w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu.Nie dopuścić do całkowitego rozmrożenia komórek.
5. Odkazić zewnętrzną powierzchnię fiolki 70% alkoholem w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Ostrożnie zdjąć korek fiolki. Nie dotykaj brzegu nakrętki ani fiolki rękami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Zawieś ponownie komórki w fiolce, delikatnie pipetując komórki 5 razy pipetą o pojemności 2 ml. Uważaj, aby nie pipetować zbyt energicznie, aby nie spowodować spienienia.
8. Zmieszaj pipetą zawiesinę komórek (1 ml) z fiolki do kolby T-75 (SIAL0641) zawierającej 15 ml pożywki Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500).
9. Zamknąć kolbę i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
10. Umieścić kolbę T-75 w 37°C, 5% CO₂ w nawilżanym inkubatorze. Poluzuj korek, aby umożliwić wymianę gazową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie należy zakłócać hodowli przez 24 godziny po inokulacji.
11. Zmień na świeżą pożywkę Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500) po 24 godzinach lub przez noc, aby usunąć wszelkie ślady DMSO.
12. Zmieniaj pożywkę Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500) co drugi dzień, aż komórki osiągną 45% konfluencji.
13. Podwoić objętość pożywki Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500), gdy hodowla osiągnie 45% konfluencji lub w przypadku karmienia weekendowego.
14. Podkulturuj komórki, gdy hodowla HEK osiągnie 80% konfluencji.

IV. Subkultura HEK

A. Przygotowanie odczynników do podhodowli

1. Wyjmij Roztwór trypsyny-EDTA (T3924) i Inhibitor trypsyny (T6414) z zamrażarki -20 °C i rozmroź przez noc w lodówce.
2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki do podhodowli są rozmrożone. Delikatnie zawiruj każdą butelkę kilka razy, aby utworzyć jednorodne roztwory.
3. Przechowuj wszystkie odczynniki do podhodowli w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
4. Odmierz roztwór trypsyny/EDTA (T3924) i przechowuj niewykorzystaną część w temperaturze -20 °C, jeśli potrzebna jest tylko część roztworu trypsyny/EDTA (T3924).

B. Przygotowanie kolby hodowlanej

1. Wyjmij Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Odmierzyć pipetą 35 ml Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500) do kolby T-175  (do użycia w Sekcji IV C Krok 15.)

C. Subkultura HEK

Trypsynować komórki w temperaturze pokojowej. Nie podgrzewaj żadnych odczynników do temperatury 37°C.

1. Usuń pożywkę z kolb hodowlanych przez aspirację.
2. Umyj monowarstwę komórek za pomocą HBSS (H6648) i usuń roztwór przez aspirację.
3. Pobierz pipetą 8 ml roztworu trypsyny/EDTA (T3924) do kolby T-75 (SIAL0641). Delikatnie potrząśnij kolbą, aby upewnić się, że roztwór pokrywa wszystkie komórki.
4. Zamknij szczelnie kolbę i monitoruj postęp trypsynizacji w temperaturze pokojowej pod odwróconym mikroskopem. Wykonuj tę czynność przez 60 sekund.
5. Ataksuj roztwór trypsyny/EDTA (T3924).
6. Ponownie zakryj kolbę i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 minuty.
7. Uwolnij zaokrąglone komórki z powierzchni hodowli, uderzając bokiem kolby o dłoń, aż większość komórek zostanie odłączona.
8. Jeśli komórki nie zostaną wizualnie odłączone, umieść kolbę w inkubatorze na dodatkowe trzydzieści sekund, a następnie powtórz krok 7.
9. Odmierzyć pipetą 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) do kolby, aby zahamować dalszą aktywność tryptyczną.
10. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
11. Przepłucz kolbę dodatkowymi 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) i przenieś roztwór do tej samej probówki stożkowej.
12. Zbadaj kolbę T-75 pod mikroskopem. Jeśli w kolbie pozostało 20% komórek, powtórz kroki 2-9.
13. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 220 x g przez 5 minut, aby osuszyć komórki.
14. Spuść supernatant z probówki bez naruszania osadu komórek.
15. Przesuń palcem końcówkę probówki stożkowej, aby poluzować osad komórek.
16. Zawieś ponownie komórki w 2 ml pożywki Keratinocyte Serum-Free Growth Medium for fetal and neonatal cells (131-500) delikatnie pipetując komórki w celu rozbicia grudek.
17. Zlicz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zaszczepić 7 500 komórek na cm² dla szybkiego wzrostu lub 5 000 komórek na cm² dla regularnych podhodowli.

.