Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste i pożywki wzrostowe

Produkty te są dostępne w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie i wybranych krajach europejskich.

• Primary Human Mesenchymal Stem Cell Culture System
• Protokoły hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych
• Kontrola jakości systemu hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych
• Materiały do hodowli ludzkich komórek mezenchymalnych

.Pierwotny system hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), zwane również mezenchymalnymi komórkami zrębowymi, to samoodnawiające się komórki multipotencjalne, które mogą różnicować się w różne typy komórek. Wykazano, że MSC różnicują się in vitro w adipocyty, chondrocyty, osteoblasty, miocyty i komórki wysepek ß-trzustkowych. MSC mogą również różnicować się w komórki neuronalne i hepatocyty.

PromoCell^® Mezenchymalne komórki macierzyste są wytwarzane z normalnych ludzkich tkanek różnego pochodzenia, w tym szpiku kostnego, macierzy pępowinowej i tkanki tłuszczowej. Różnicowanie MSC w adipocyty, osteoblasty, chondrocyty i linie neuronalne można przeprowadzić przy użyciu podłoża do różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych. Wkrótce po izolacji wszystkie mezenchymalne komórki macierzyste są kriokonserwowane przy użyciu opatentowanego, niezawierającego surowicy podłoża do zamrażania - Cryo-SFM. Rozmrożenie i posianie komórek stanowi przejście 2 (P2). Każda kriofiolka zawiera co najmniej 500 000 żywych komórek po rozmrożeniu. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste są również dostępne jako proliferujące kultury komórkowe wygenerowane z kriokonserwowanych komórek, które zostały rozmrożone i hodowane przez trzy dni.

Podłoże do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych zostało opracowane do ekspansji i ukierunkowanego różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wyizolowanych ze szpiku kostnego, macierzy pępowinowej (galareta Whartona) lub tkanki tłuszczowej.Podłoże do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych jest dostępne jako podłoże (gotowe do użycia) i składa się z butelki pożywki podstawowej i jednej fiolki mieszanki uzupełniającej (SupplementMix); dodanie mieszanki uzupełniającej do pożywki podstawowej stanowi kompletne podłoże.

MSC Expansion Media.	MSC Differentiation Media
Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (zoptymalizowany preparat o niskiej zawartości surowicy) Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF (zdefiniowany, wolny od ksenonów preparat, który wymaga naczyń pokrytych fibronektyną)<	Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium 2 Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium Podłoże do różnicowania chondrogennego mezenchymalnych komórek macierzystych Podłoże do różnicowania chondrogennego mezenchymalnych komórek macierzystych bez induktorów Podłoże do różnicowania neurogennego mezenchymalnych komórek macierzystych

Szczegóły suplementacji pożywki do mezenchymalnych komórek macierzystych

Podłoże do mezenchymalnych komórek macierzystych zawiera wszystkie czynniki wzrostu i suplementy potrzebne do optymalnej ekspansji i ukierunkowanego różnicowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Podłoże do wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych DXF, podłoże do różnicowania chondrogenicznego MSC, podłoże do różnicowania chondrogenicznego MSC bez induktorów i podłoże do różnicowania neurogenicznego MSC są zdefiniowane i nie zawierają surowicy. Podłoże do mezenchymalnych komórek macierzystych nie zawiera antybiotyków ani środków przeciwgrzybiczych i jest przeznaczone do stosowania w inkubatorze z atmosferą 5% CO₂.

Uwaga: Podłoże do różnicowania chondrogenicznego MSC bez induktorów musi być uzupełnione przez użytkownika odpowiednimi induktorami chondrogenicznymi.

Powłoka powierzchni naczyń do hodowli MSC

Podłoże MSC Growth Medium DXF nie zawiera czynników przylegania i rozprzestrzeniania. Dlatego naczynia hodowlane używane z MSC Growth Medium DXF muszą być wstępnie pokryte ludzką fibronektyną 10 μg / ml zgodnie z protokołem producenta.  Alternatywnie można zastosować fibronektynę bydlęcą.

Przygotowanie pożywki uzupełniającej do hodowli MSC

• Odmrozić mieszankę uzupełniającą w łaźni wodnej lub termicznej o temperaturze 37°C, od czasu do czasu mieszając. Uwaga: Nie inkubować dłużej niż to konieczne. W przypadku widocznych osadów po całkowitym rozmrożeniu, delikatnie mieszaj, aż wszystkie osady ponownie się rozpuszczą.
• Przenieś całą zawartość każdego suplementu do pożywki podstawowej.
• Zamknij butelkę i delikatnie wiruj, aż utworzy się jednorodna mieszanina.

Przechowywanie i stabilność produktów MSC

• Po dostarczeniu natychmiast przechowywać Basal Medium w temperaturze 4 - 8°C w ciemności; nie zamrażać Basal Medium. Przechowywać SupplementMix w temperaturze -20°C.
• Jeśli produkty są przechowywane zgodnie z zaleceniami, zachowują stabilność do podanej daty ważności.
• Po dodaniu suplementów do Basal Medium, okres przechowywania kompletnego podłoża wynosi sześć tygodni w temperaturze 4-8°C. Nie zamrażać kompletnej pożywki.
• Do użytku, pobrać i podgrzać tylko objętość kompletnej pożywki wymaganą do jednorazowego użycia, a pozostałą pożywkę przechowywać w lodówce w temperaturze 4 - 8°C.
• Po dostarczeniu, kriokonserwowane MSC powinny być wysiewane bezpośrednio lub natychmiast przechowywane w ciekłym azocie.
• Proliferujące MSC muszą być przetwarzane natychmiast.

Protokoły hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych<

Protokół postępowania z kriokonserwowanymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

Ważne uwagi:

• Natychmiast po dostarczeniu, przechowuj kriokonserwowane komórki w ciekłym azocie lub natychmiast je posiej. Przechowywanie w temperaturze -80°C nie jest wystarczające do zachowania komórek i powoduje ich nieodwracalne uszkodzenie.
• Przechowywać z zastosowaniem technik aseptycznych i w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym
• Naczynia hodowlane pokryte fibronektyną są wymagane do stosowania z pożywką MSC Growth Medium DXF (patrz krok 1b przygotowania pożywki).

1. Przygotuj pożywkę
   
   a.) Dla MSC Growth Medium 2
   
   Oblicz wymaganą powierzchnię hodowli zgodnie z zalecaną gęstością posiewu (patrz tabela poniżej) i liczbą komórek specyficzną dla partii podaną w certyfikacie analizy. Napełnij naczynia do hodowli komórkowych odpowiednią objętością PromoCell® Growth Medium (co najmniej 9 ml na fiolkę z komórkami). Umieścić naczynia w inkubatorze (37°C, 5% CO₂) na 30 minut.
   
   b.) Dla MSC Growth Medium DXF
   
   Obliczyć wymaganą powierzchnię hodowli zgodnie z zalecaną gęstością posiewu (patrz tabela poniżej) i liczbą komórek dla danej partii podaną w certyfikacie analizy. Pokryć naczynia hodowlane 10 µg/cm² ludzką lub bydlęcą fibronektyną zgodnie z instrukcjami producenta. Napełnić wstępnie pokryte naczynia odpowiednią objętością pożywki PromoCell Growth Medium (co najmniej 9 ml na fiolkę z komórkami). Umieść naczynia w inkubatorze (37°C, 5% CO₂) na 30 minut.
   
   
2. Rozmrażanie komórek
   Wyjmij fiolkę z pojemnika z ciekłym azotem i natychmiast umieść ją w suchym lodzie - nawet na czas krótkiego transportu. W komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym krótko przekręć korek o ćwierć obrotu, aby zmniejszyć ciśnienie, a następnie ponownie dokręć. Zanurzyć fiolkę w łaźni wodnej (37°C) aż do zakrętki na 2 minuty. Upewnij się, że woda nie dostała się do gwintu zakrętki.
   
   
3. Dezynfekcja fiolki i posiew komórek
   Dokładnie przepłucz fiolkę 70% etanolem w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym. Następnie odessać nadmiar etanolu z obszaru gwintu zakrętki. Otwórz fiolkę i przenieś komórki do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego wstępnie ogrzaną pożywkę z kroku 1.
    
4. Inkubuj komórki
   Umieść naczynie w inkubatorze (37°C, 5% CO₂) w celu przyłączenia komórek. Wymień pożywkę po 3-4 godzinach, a następnie co dwa do trzech dni. Komórki powinny być subkulturowane zgodnie z protokołem subkulturowania (patrz poniżej) po osiągnięciu 70-90% konfluencji.

Protokół postępowania z proliferującymi ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

Ważne uwagi:

• Zacznij natychmiast po dostarczeniu komórek.
• Używaj technik aseptycznych i komory bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.
• Do hodowli z użyciem MSC Growth Medium DXF potrzebne są plastikowe naczynia pokryte fibronektyną (patrz Protokół dla komórek kriokonserwowanych, krok 1b).

1. Inkubuj komórki
   Rozpakuj naczynie hodowlane, nie otwieraj pokrywy i natychmiast umieść je w inkubatorze (37°C, 5% CO₂) na 3 godziny, aby umożliwić komórkom regenerację po transporcie.
   
   
2. Wymień podłoże transportowe
   Ostrożnie otwórz naczynie, opłucz wewnętrzną stronę pokrywy 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Odessać medium transportowe (Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2) z naczynia. Dodaj 10 ml odpowiedniej pożywki PromoCell^® Cell Growth Medium.
   
   
3. Sprawdź i inkubuj komórki
   Sprawdź gęstość komórek. Otwórz zakrętkę o pół obrotu w celu odpowietrzenia lub użyj kolb z odpowietrzoną zakrętką i umieść naczynie w inkubatorze (37°C, 5% CO₂). Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni. Komórki powinny być subkulturowane zgodnie z poniższym protokołem subkulturowania po osiągnięciu 70% konfluencji.

Protokół podhodowli mezenchymalnych komórek macierzystych

Ważne uwagi:

• Do hodowli z użyciem MSC Growth Medium DXF wymagane są naczynia pokryte fibronektyną (patrz Protokół dla komórek kriokonserwowanych, krok 1b).
• Do rutynowej subkultury ludzkich MSC zaleca się stosowanie odczynnika do dysocjacji Accutase^® z wszystkimi pożywkami MSC Growth Medium.
• Używaj technik aseptycznych i szafy bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.

1. Przygotować odczynniki i umyć komórki
   Umieścić roztwór Accutase^® Solution w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut w celu dostosowania temperatury odczynników. Ostrożnie odessać pożywkę z naczynia hodowlanego. Dodać 100 µL roztworu HEPES BSS na cm² powierzchni naczynia w celu przepłukania komórek i ostrożnie mieszać naczynie przez 15 sekund.
   
   
2. Odłącz komórki
   Ostrożnie odessać bufor HEPES BSS z naczynia hodowlanego. Dodaj 100 µL roztworu Accutase na cm² powierzchni naczynia i inkubuj przez 2-4 minuty w temperaturze pokojowej. Zamknąć naczynie i obejrzeć komórki pod mikroskopem. Gdy komórki zaczną się oddzielać, delikatnie postukaj w bok naczynia, aby rozluźnić pozostałe komórki.
   
   
3. Zbierz komórki
   Ostrożnie odessaj zawiesinę komórek i przenieś ją do probówki do wirowania. Wiruj komórki przez 3 minuty z prędkością 220 x g.
   
   
4. Inkubuj komórki
   Odrzuć supernatant, dodaj 1 ml odpowiedniej pożywki do wzrostu komórek i ponownie zawieś komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Umieść komórki zgodnie z zalecaną gęstością wysiewu w nowych sterylnych naczyniach do hodowli komórkowej zawierających podgrzaną pożywkę do hodowli komórek. Umieść naczynia w inkubatorze (37°C, 5% CO₂) i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni.

Kontrola jakości systemu hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

.

Kontrola jakości ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Sztywne testy kontroli jakości są przeprowadzane dla każdej partii ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych.

• Testowane pod kątem morfologii komórek, potencjału proliferacyjnego, wskaźnika przylegania i żywotności komórek.
• Charakteryzowane za pomocą analizy cytometrii przepływowej kompleksowego panelu markerów, w tym CD73/CD90/CD105 i CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR, zgodnie z ISCT [1].
• Testy różnicowania do linii adipogennej, osteogennej i chondrogennej są wykonywane dla każdej partii w warunkach hodowli bez antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych.
• Testowane na nieobecność HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, HTLV-1, HTLV-2 i zanieczyszczeń mikrobiologicznych (grzybów, bakterii i mykoplazmy).
• Szczegółowy certyfikat analizy (CoA) dla każdej partii jest dostępny do pobrania.

Specyfikacje ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Produkt	Zalecane pożywki	Zalecane pożywki do różnicowania	Gęstość namnażania
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste ze szpiku kostnego (hMSC-BM)	C-28009 C-28019	C-28016 C-28012 C-28013 C-28014 C-28015	4 000 komórek na cm²
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste z macierzy pępowinowej (hMSC-UC)	C-28009 C-28019	C-28016 C-28012 C-28013 C-28014 C-28015	4,000 komórek na cm²
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste z tkanki tłuszczowej (hMSC-AT)	C-28009 C-28019	C-28016 C-28012 C-28013 C-28014 C-28015	4,000 komórek na cm²

Kontrola jakości pożywki dla mezenchymalnych komórek macierzystych

Wszystkie partie pożywki dla mezenchymalnych komórek macierzystych PromoCell^® Mesenchymal Stem Cell Media są poddawane kompleksowym testom kontroli jakości z wykorzystaniem pierwotnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Każda partia MSC Growth Medium jest walidowana pod kątem utrzymania multipotencji, aktywności stymulującej wzrost, wskaźnika adherencji i typowej morfologii testowanych mezenchymalnych komórek macierzystych. Każda partia pożywki do różnicowania MSC jest testowana pod kątem zdolności do indukowania ukierunkowanego różnicowania MSC do określonych linii komórkowych. Ponadto wszystkie partie pożywek zostały przetestowane pod kątem braku zanieczyszczeń mikrobiologicznych (grzybów, bakterii, mykoplazmy).

Przeznaczenie mezenchymalnych komórek macierzystych i systemu pożywek

Produkty te są przeznaczone wyłącznie do użytku in vitro i nie są przeznaczone do procedur diagnostycznych ani terapeutycznych. Środki ostrożności można znaleźć w odpowiedniej karcie charakterystyki produktu.