Trójliniowe różnicowanie multipotencjalnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w osteocyty, adipocyty i chondrocyty

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to fibroblastoidalne multipotencjalne dorosłe komórki macierzyste o wysokiej zdolności do samoodnowy i różnicowania. Komórki te zostały wyizolowane z kilku ludzkich tkanek, w tym szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej, macierzy pępowinowej, ścięgien, płuc i okostnej.¹ Ostatnio wykazano, że MSC pochodzą z niszy okołonaczyniowej, ścisłej sieci obecnej w układzie naczyniowym całego ciała. Te komórki okołonaczyniowe nie posiadają markerów śródbłonkowych i hematopoetycznych, np. CD31, CD34 i CD45, ale wykazują ekspresję CD146, PDGFR beta i fosfatazy alkalicznej.² Zgodnie ze stanowiskiem opublikowanym przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT), MSC wyrażają markery powierzchniowe CD73, CD90 i CD105 i barwią się negatywnie na CD14 lub CD11b, CD34, CD45, CD79α lub CD19 i HLADR.³ Oprócz analizy markerów powierzchniowych, najbardziej powszechnym i niezawodnym sposobem identyfikacji populacji MSC jest weryfikacja ich multipotencji. MSC mogą różnicować się w adipocyty, osteoblasty, miocyty i chondrocyty in vivo i in vitro.^1,4 Transdyferencjację MSC w komórki pochodzenia niemezenchymalnego, takie jak hepatocyty, neurony i komórki wysepek trzustkowych, zaobserwowano również in vitro, gdy zastosowano określone warunki hodowli i bodźce.¹ Ukierunkowane różnicowanie MSC jest przeprowadzane in vitro przy użyciu odpowiednich pożywek do różnicowania, takich jak gotowe do użycia pożywki PromoCell MSC Differentiation Media (C-28016, C-28012, C-28014, C-28013, C-28015).

Czytaj więcej o

• .Protokół różnicowania osteogenezy
• Protokół różnicowania osteogenezy.
• Protokół różnicowania chondrogenezy
• Produkty powiązane
• Referencje

Rysunek 1. Różnicowanie in vitro ludzkich MSC. W odpowiednich warunkach hodowlanych multipotencjalne ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste mogą różnicować się w osteoblasty, adipocyty, chondrocyty, miocyty i neurony.

Protokół różnicowania osteogenezy

1. Pokryć naczynie hodowlane.Pokryć 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej 10 μg/mL ludzkiej fibronektyny lub bydlęcej fibronektyny zgodnie z instrukcją obsługi.
2. Nakładanie mezenchymalnych komórek macierzystych.Umieść MSC w ilości 1x10⁵ komórek na studzienkę na płytce do hodowli tkankowej pokrytej fibronektyną, używając MSC Growth Medium 2 (C-28009). Pracuj w dwóch egzemplarzach.
3. Pozwól mezenchymalnym komórkom macierzystym rosnąć. Pozwól komórkom osiągnąć 80-90% konfluencji. Zajmie to 24-48 godzin.
4. Idukuj mezenchymalne komórki macierzyste. Indukuj jedną z zduplikowanych próbek za pomocą MSC Osteogenic Differentiation Medium (C-28013). Użyj MSC Growth Medium 2 dla pozostałej studzienki jako kontroli negatywnej.
5. Indukuj mezenchymalne komórki macierzyste. Inkubuj przez 12-14 dni. Zmieniaj pożywkę co trzeci dzień. Należy uważać, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
6. Płukanie komórek. Po zakończeniu etapów różnicowania należy wyjąć komórki z inkubatora i ostrożnie odessać pożywkę. Delikatnie przemyj komórki buforem fosforanowym Dulbecco (PBS) bez Ca++/Mg++  (D8537).
7. Utrwal komórki. Ostrożnie odessać PBS i dodać wystarczającą ilość roztworu utrwalającego Saccomanno, aby pokryć monowarstwę komórek. Po co najmniej 30 minutach delikatnie odessać roztwór utrwalający i przemyć komórki wodą destylowaną.
8. Stain the cells.Bezpośrednio przed użyciem przepuścić wymaganą ilość roztworu barwiącego czerwieni Alizarin Red S (TMS008) przez filtr Millex PES 0,22 μm. Ostrożnie odessać wodę destylowaną i dodać wystarczającą ilość przefiltrowanego roztworu barwiącego Alizarin Red S, aby pokryć monowarstwę komórkową. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10-15 minut. Monitorować postęp barwienia przez 10 minut i zatrzymać proces, gdy intensywność barwienia jest wystarczająca.
9. Płukanie komórek.  Ostrożnie odessać roztwór barwiący czerwieni alizarynowej S i czterokrotnie przemyć monowarstwę komórek 1 ml wody destylowanej. Ostrożnie odessać wodę destylowaną i dodać PBS.
10. Analiza komórek Analizuj próbkę natychmiast, ponieważ barwnik może krwawić po dłuższym przechowywaniu bez osadzania. Niezróżnicowane MSC (bez zewnątrzkomórkowych złogów wapnia) są bezbarwne / lekko fioletowe, podczas gdy osteoblasty pochodzące z MSC (z zewnątrzkomórkowymi złogami wapnia) barwią się na jasno pomarańczowo-czerwono (Rysunek 1).

Rysunek 2.

Protokół różnicowania adipogenezy

1. Pokryć naczynie hodowlane.Pokryć 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej fibronektyną ludzką o stężeniu 10 μg/mL lub fibronektyną bydlęcą zgodnie z instrukcją obsługi.
2. Siej mezenchymalne komórki macierzyste.Na pokrytej fibronektyną 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej umieść 1 x 10⁵ MSC na studzienkę przy użyciu MSC Growth Medium 2 (C-28009).
3. Pozwól mezenchymalnym komórkom macierzystym rosnąć. Pozwól komórkom osiągnąć 80-90% konfluencji. Zajmie to 24-48 godzin.
4. Indukuj mezenchymalne komórki macierzyste.Indukuj jedną z zduplikowanych próbek za pomocą MSC Adipogenic Differentiation Medium 2 (C-28016). Użyj MSC Growth Medium 2 dla pozostałej studzienki jako kontroli negatywnej.
5. Różnicowanie indukowanych mezenchymalnych komórek macierzystych. Inkubować przez 12-14 dni. Zmieniaj pożywkę co trzeci dzień, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
6. Płukanie komórek. Po zakończeniu etapów różnicowania wyjmij komórki z inkubatora i ostrożnie odessij pożywkę. Delikatnie przemyj komórki buforem fosforanowym Dulbecco (PBS) bez Ca⁺⁺/Mg⁺⁺  (D8537).
7. Utwierdzić komórki.  Ostrożnie odessać PBS (D8537) i dodać wystarczającą ilość Saccomanno Fixation Solution, aby pokryć monowarstwę komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
8. Umyć komórki.  Ostrożnie odessać bufor utrwalający i przemyć monowarstwę komórek wodą destylowaną. Delikatnie odessać wodę i dodać wystarczającą ilość 60% izopropanolu do pokrycia monowarstwy komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
9. Pokryć komórki.Ostrożnie odessać 60% izopropanol i dodać wystarczającą ilość roztworu barwiącego OilRedO (O1391), aby pokryć monowarstwę komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 min.
10. Umyć komórki.  Ostrożnie odessać roztwór barwiący i przemyć monowarstwę komórek kilka razy wodą destylowaną, aż woda będzie czysta. Osuszyć naczynie zawierające wybarwione komórki do góry dnem na ręczniku papierowym, aby usunąć jak najwięcej wody.
11. Analiza komórek.  Przykryć PBS i szybko przeanalizować wybarwione próbki, ponieważ barwnik ma tendencję do blaknięcia po dłuższej ekspozycji na światło. Wewnątrzkomórkowe pęcherzyki lipidowe w dojrzałych adipocytach będą zabarwione na jasnoczerwony kolor.

Rysunek 3. Barwienie olejem czerwonym O kropelek lipidów w adipocytach pochodzących z hMSC-BM. Akumulacja pęcherzyków lipidowych w adipocytach zróżnicowanych z hMSC-BM (ludzkie MSC pochodzące ze szpiku kostnego) przy użyciu PromoCell MSC Adipogenic Differentiation Medium 2. Zróżnicowana hodowla wykazuje rozległe wewnątrzkomórkowe tworzenie wakuoli lipidowych typowych dla dojrzałych adipocytów (po lewej: powiększenie 40x; po prawej: powiększenie 100x).

Protokół różnicowania chondrogenezy

1. Przygotowanie pożywki kontroli negatywnej.Pożywką do kontroli negatywnej jest zmodyfikowana pożywka Dulbecco Eagle'a (DMEM, o niskiej zawartości glukozy) z 2 mM L-glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą.
2. Seed Mesenchymal Stem Cells. Umieść MSC w ilości 2 x 10⁵ komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce do hodowli zawiesinowej Ubottom, używając pożywki kontroli negatywnej. Pracować w dwóch egzemplarzach.
3. Tworzenie sferoidów MSC. Sferoidy utworzą się spontanicznie w ciągu 24-48 godzin inkubacji.
4. Indukowanie sferoidów MSC.Wywołaj jedną ze zduplikowanych próbek za pomocą MSC Chondrogenic Differentiation Medium (C-28012). Do pozostałych dołków użyj pożywki z kontroli negatywnej.
5. Różnicowanie indukowanych MSC-sferoidów. Inkubuj przez 21 dni. Zmieniaj pożywkę co trzeci dzień, uważając, aby nie zasysać sferoidów.
6. Płukanie sferoidów chrząstki. Po zakończeniu etapów różnicowania wyjmij komórki z inkubatora i ostrożnie zasysaj pożywkę. Delikatnie przemyj sferoidy buforem fosforanowym Dulbecco (PBS) bez Ca⁺⁺/Mg⁺⁺  (D8537).
7. Utrwalanie sferoidów chrząstki.  Ostrożnie odessać PBS. Dodaj wystarczającą ilość roztworu utrwalającego Saccomanno, aby pokryć sferoidy chrząstki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
8. Płukanie sferoidów chrząstki.  Ostrożnie odessać utrwalacz i przemyć sferoidy dwukrotnie wodą destylowaną.
9. Konserwowanie komórek.Bezpośrednio przed użyciem przepuścić wymaganą ilość roztworu barwiącego Alcian Blue (TMS010) przez filtr Millex PES 0,22 μm. Ostrożnie odessać wodę destylowaną i dodać wystarczającą ilość przefiltrowanego roztworu barwiącego Alcian Blue, aby obficie pokryć sferoidy chrząstki, ponieważ nastąpi pewne odparowanie. Inkubować w ciemności przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
10. Umyć komórki.  Ostrożnie odessać roztwór barwiący błękitem Alcian i myć sferoidy chrząstki roztworem odbarwiającym przez 10 minut. Powtórzyć etap płukania dwukrotnie. Ostrożnie odessać roztwór odbarwiający i dodać PBS.
11. Analiza sferoidów chrząstki. Chrząstka będzie zabarwiona na intensywny ciemnoniebieski kolor, podczas gdy inne tkanki będą co najwyżej zabarwione na jasnoniebiesko.

.

Rysunek 4. Barwienie błękitem Alcian chondrocytów pochodzących z hMSC-BM. Sferoidy MSC po różnicowaniu in vitro w chrząstkę przy użyciu PromoCell MSC Chondrogenic Differentiation Medium. Sferoidy hodowane w negatywnej pożywce kontrolnej zabarwiają się na jasnoniebiesko (górny rząd). Natomiast indukowane sferoidy wykazują intensywnie niebieski kolor wskazujący na macierz zewnątrzkomórkową chrząstki (dolny rząd).

Referencje

1. da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. 2008. In Search of the In Vivo Identity of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells. 26(9):2287-2299. https://doi.org/10.1634/stemcells.2007-1122

2. Crisan M, Yap S, Casteilla L, Chen C, Corselli M, Park TS, Andriolo G, Sun B, Zheng B, Zhang L, et al. 2008. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3(3):301-313. https://doi.org/10.1016/j.stem.2008.07.003

3. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop D, Horwitz E. 2006. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8(4):315-317. https://doi.org/10.1080/14653240600855905

4. Caplan A. 2008. Cell Stem Cell. 3(3):229-30