Usuwanie detergentów z produktów biologicznych

J. Patrick Myers

US Reporter Volume 30.3

Większość nowoczesnych badań i produkcji biofarmaceutycznych wymaga użycia jednego lub więcej detergentów. Detergenty to amfipatyczne cząsteczki o właściwościach zarówno hydrofilowych, jak i hydrofobowych. Te unikalne właściwości są wykorzystywane do zmiany interakcji między cząsteczkami biologicznymi w roztworach wodnych.

Detergenty są podzielone na szerokie klasy w oparciu o charakter polarnej, hydrofilowej części cząsteczki. Klasy te obejmują jonowe (dalej podzielone na ujemnie naładowane anionowe i dodatnio naładowane kationowe), niejonowe (nienaładowane) i zwitterionowe (posiadające zarówno dodatnio, jak i ujemnie naładowane grupy, ale o zerowym ładunku netto). W odpowiednich warunkach detergenty tworzą micele w wodzie.

Micela to trójwymiarowa struktura powstająca, gdy stężenie detergentu wzrasta w wodzie powyżej ilości, która może utworzyć monowarstwę na powierzchni. Micele są zazwyczaj kulami, w których hydrofobowe części cząsteczek detergentu łączą się ze sobą, podczas gdy hydrofilowe części cząsteczek stykają się z wodą[1]. Liczba cząsteczek detergentu na micelę (liczba agregacji) i zakres stężenia detergentu, powyżej którego tworzą się micele (zwany krytycznym stężeniem miceli, CMC) są właściwościami specyficznymi dla każdego detergentu. Krytyczna temperatura miceli (CMT) to najniższa temperatura, w której mogą tworzyć się micele. Poniżej CMT cząsteczki detergentu występują w roztworze w postaci krystalicznej i nie są skuteczne. Powyżej CMT detergenty tworzą micele i stają się skuteczne w zakłócaniu interakcji lipid-lipid.

Cząsteczki tworzące błony biologiczne są również amfipatyczne². Składają się z polarnych "głów" połączonych z lipofilowymi, hydrofobowymi "ogonami". Stabilne błony powstają, gdy "ogony" cząsteczek łączą się ze sobą w układzie przypominającym arkusz dwuwarstwowy, pozostawiając polarne "głowy" w kontakcie z polarnym, wodnym środowiskiem po obu stronach błony. Dodatkowe cząsteczki osadzone w dwuwarstwie lipidowej, w tym białka i cholesterol, są ważne dla elastyczności i funkcji błony. Tworzenie miceli detergentowych jest ważne, ponieważ umożliwia dyspersję nierozpuszczalnych w wodzie, hydrofobowych związków w roztworach wodnych. Pozwala również na rozerwanie błon biologicznych i ekstrakcję białek. Dezintegracja błon następuje poprzez zakłócenie interakcji lipid-lipid i lipid-białko w błonie.

W badaniach biologicznych i produkcji biofarmaceutycznej detergenty są wykorzystywane do wielu celów. Obejmują one stabilizację białek i kwasów nukleinowych podczas elektroforezy; rozpuszczanie białek błonowych; zapobieganie niespecyficznemu wiązaniu w procedurach oczyszczania powinowactwa i testów immunologicznych; kontrolę krystalizacji białek; oraz rozrywanie błon komórkowych w celu uwolnienia białek związanych z błoną i wewnątrzkomórkowych.

W produkcji biofarmaceutycznej detergent musi zostać usunięty z produktu podczas dalszych czynności przetwarzania^3,4,5. Metody usuwania detergentów obejmują filtrację żelową, wykluczenie wielkości, dializę i hydrofobową chromatografię adsorpcyjną. Dane przedstawione w Tabelach 1 i 2 pokazują, że wstępnie zapakowane, sterylne, wolne od endotoksyn wkłady Porozorb™ mogą być również stosowane do skutecznego usuwania detergentów i innych niepolarnych, hydrofobowych materiałów z preparatów biologicznych.

Tabela 1 pokazuje wydajność różnych wkładów Porozorb dla kilku popularnych detergentów używanych w zastosowaniach biofarmaceutycznych.Tabela 2 pokazuje czas wymagany do zredukowania 0,1% stężenia jednego z tych detergentów, Triton^® X-100, w 10-litrowym roztworze poniżej wykrywalnych poziomów.

Tabela 1. Pojemność wkładów Porozorb dla różnych detergentów

					Obliczona pojemność nasycenia
Porozorb Cartridge	Cat. No.	Objętość złoża (ml)	ID (cm)	Długość (cm)	Triton X-100 (g)/ kartridż	SDS (g)/ kartridż	CHAPS (g)/ wkład
254	57500	250	8	6.55	44	125	78
1004	57502	1000	8	26.2	168.8	462	288
4004	57513-U	4000	12.71	42.04	504	1400	873.6

Tabela 2. Czas wymagany do zredukowania 0,1% detergentu Triton X-100 w 10-litrowym roztworze poniżej poziomu wykrywalności. (Detergent wykrywany przez monitorowanie absorbancji przy 275 nm)

	Przepływ 3.6 litrów/godzinę		Przepływ 10,3 litra/godzinę		Przepływ 22.8 litrów/godzinę
Objętość złoża (ml)	Objętość przełamania (litr)	Czas recyrkulacji (godzina)	Przełomowa objętość (litr)	Czas recyrkulacji (godzina)	Objętość przebicia (litr)	Czas recyrkulacji (godzina)
250	3	11	<1	6	<1	3
1000	brak	9	50	3.5	1	2
4000	none	7	none	2	>40	1.5

Żywica AMBERLITE^® XAD-4 (Rysunek 1) stosowana we wkładach Porozorb™ to sprawdzona technologia, która jest wysoce skuteczna w usuwaniu różnych detergentów z pożywek do hodowli komórkowych w zastosowaniach biofarmaceutycznych, takich jak produkcja szczepionek.

Rysunek 1. Struktura hydrofobowej makroretikularnej kulki żywicznej

Kartridże Porozorb (Rysunek 2) są jednorazowe i dostępne w rozmiarach odpowiednich dla schematów oczyszczania w skali analitycznej i procesowej.

Rysunek 2. Jednorazowe wkłady Porozorb (4 l i 1 l)

Żywica AMBERLITE XAD-4 zawarta we wkładzie Porozorb™ jest czyszczona bez użycia substancji organicznych, a także testowana pod kątem pozostałości (CFR 21: 173.65)[6] i substancji organicznych. Każdy wkład jest pakowany oddzielnie i towarzyszy mu certyfikat analizy sterylności i endotoksyczności. Testy sterylności są zgodne z wytycznymi USP XXIII. Endotoksyczność jest testowana przy użyciu zwalidowanego zestawu LAL, przy czym każdy wykrywalny poziom endotoksyny (0,03 EU / ml) wskazuje na pozytywny wynik testu. Wkłady Porozorb mogą być również pakowane z różnymi innymi żywicami i nośnikami, aby spełnić specyficzne potrzeby aplikacji. Ponadto możemy dostarczyć materiały luzem i/lub mniejsze wstępnie zapakowane urządzenia do opracowania metody - skontaktuj się z Supelco custom services.

Referencje

1. Available from: http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5558F7E4-5056-8A76-4E55- 4F3977738B63

2. Available from: http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/detergents/ANATRACE_DetergentsUse.pdf

3. Varha? R, Robinson NC, Musatov A. 2009. Removal of bound Triton X-100 from purified bovine heart cytochrome bc1. Analytical Biochemistry. 395(2):268-270. https://doi.org/10.1016/j.ab.2009.08.042

4. Available from: http://www.rohmhaas.com/ionexchange/pharmaceuticals/detergent_removal.htm

5. Trescec A, Simic M, Branovic K, Gebauer B, Benko B. 1999. Removal of detergent and solvent from solvent?detergent-treated immunoglobulins. Journal of Chromatography A. 852(1):87-91. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(99)00178-8

6. Electronic Code of Federal Regulations 21 CFR 173.65. Available from: https://www.ecfr.gov/

Znaki towarowe
AMBERLITE i Triton są zastrzeżonymi znakami towarowymi The Dow Chemical Company lub spółki stowarzyszonej Dow

.