Chromatografia powinowactwa w strategii oczyszczania (CIPP)
AC oddziela białka na podstawie odwracalnej interakcji między białkiem (lub grupą białek) a określonym ligandem połączonym z matrycą chromatograficzną. Przy tak wysokiej selektywności, a tym samym wysokiej rozdzielczości dla interesującego białka (białek), można osiągnąć poziomy oczyszczania rzędu kilku tysięcy razy z wysokim odzyskiem materiału aktywnego. Próbki są zagęszczane podczas wiązania, a docelowe białko (białka) jest zbierane w oczyszczonej, skoncentrowanej formie. AC może zatem zaoferować ogromną oszczędność czasu w porównaniu z mniej selektywnymi procedurami wieloetapowymi.
W wielu przypadkach wysoki poziom czystości osiągnięty w AC wymaga co najwyżej tylko drugiego etapu na kolumnie SEC w celu usunięcia niepożądanych małych cząsteczek, takich jak sole lub agregaty.
Dla jeszcze wyższego stopnia czystości lub gdy nie ma odpowiedniego liganda do dokładnego oczyszczenia, można zastosować wydajny wieloetapowy proces.Wydajny wieloetapowy proces można opracować przy użyciu strategii oczyszczania polegającej na wychwytywaniu, oczyszczaniu pośrednim i polerowaniu (CIPP), pokazanej na Rysunku 9.1.
CIPP jest stosowana zarówno w przemyśle farmaceutycznym, jak i w laboratorium badawczym, aby zapewnić szybsze opracowanie metody, krótszy czas uzyskania czystego produktu i dobrą ekonomię. AC może być stosowana, w połączeniu z innymi technikami chromatograficznymi, jako skuteczny etap wychwytywania lub pośredni w strategii CIPP .
Niniejszy rozdział zawiera krótki przegląd podejścia zalecanego dla każdego wieloetapowego oczyszczania białek.Podręcznik Strategies for Protein Purification firmy Cytiva jest wysoce zalecany jako przewodnik do planowania wydajnych i skutecznych strategii oczyszczania białek oraz do wyboru właściwego podłoża dla każdego etapu i skali oczyszczania.
Rysunek 9.1. Przygotowanie i CIPP.
Zastosowanie CIPP
Wyobraź sobie, że oczyszczanie ma trzy fazy: Przechwytywanie, Oczyszczanie pośrednie i Polerowanie.
Przypisać konkretny cel do każdego etapu procesu oczyszczania.
Kwestie związane z konkretnym etapem oczyszczania będą w dużej mierze zależeć od właściwości materiału wyjściowego. Tak więc cel etapu oczyszczania będzie się różnił w zależności od jego pozycji w procesie.
W fazie wychwytywania celem jest izolacja, zatężenie i stabilizacja produktu docelowego. Produkt powinien być skoncentrowany i przeniesiony do środowiska, które zachowa moc/aktywność.
Podczas pośredniej fazy oczyszczania, celem jest usunięcie większości zanieczyszczeń, takich jak inne białka i kwasy nukleinowe, endotoksyny i wirusy.
W fazie polerowania, większość zanieczyszczeń została już usunięta. Celem jest osiągnięcie ostatecznej czystości poprzez usunięcie wszelkich pozostałych śladowych zanieczyszczeń lub blisko spokrewnionych substancji.
Optymalny wybór i połączenie technik oczyszczania dla Przechwytywania, oczyszczania pośredniego i polerowania ma kluczowe znaczenie dla skutecznego oczyszczania.
CIPP nie oznacza, że zawsze muszą istnieć trzy etapy oczyszczania. Na przykład, wychwytywanie i pośrednie oczyszczanie może być osiągalne w jednym etapie, podobnie jak pośrednie oczyszczanie i polerowanie. Podobnie, wymagania dotyczące czystości mogą być tak niskie, że szybki etap wychwytywania jest wystarczający do osiągnięcia pożądanego rezultatu. W przypadku oczyszczania białek terapeutycznych może być wymagany czwarty lub piąty etap oczyszczania, aby spełnić najwyższe wymagania dotyczące czystości i bezpieczeństwa. Liczba zastosowanych etapów będzie zawsze zależeć od wymagań czystości i zamierzonego zastosowania białka.
Wybór i kombinacja technik oczyszczania
Białka są oczyszczane przy użyciu technik oczyszczania, które rozdzielają się zgodnie z różnicami w specyficznych właściwościach, jak pokazano w Tabeli 9.1.
Podczas planowania każdego etapu oczyszczania należy wziąć pod uwagę cztery ważne parametry wydajności: rozdzielczość, pojemność, szybkość i odzyskiwanie. Optymalizacja każdego z tych czterech parametrów może być osiągnięta tylko kosztem innych, a każdy etap oczyszczania będzie kompromisem (Rysunek 9.2). Znaczenie każdego parametru będzie się różnić w zależności od tego, czy etap oczyszczania jest używany do wychwytywania, oczyszczania pośredniego czy polerowania. Metody oczyszczania powinny być wybrane i zoptymalizowane, aby spełnić cele dla każdego etapu oczyszczania.
Rysunek 9.2. Kluczowe parametry wydajności oczyszczania białek. Każdy etap oczyszczania powinien być zoptymalizowany pod kątem jednego lub dwóch parametrów.
Pojemność, w przedstawionym prostym modelu, odnosi się do ilości białka docelowego załadowanego podczas oczyszczania. W niektórych przypadkach ilość próbki, którą można załadować, będzie ograniczona objętością (jak w SEC) lub dużymi ilościami zanieczyszczeń, a nie ilością białka docelowego.
Szybkość jest najważniejsza na początku oczyszczania, gdzie zanieczyszczenia, takie jak proteazy, muszą być usunięte tak szybko, jak to możliwe.
Odzyskiwanie staje się coraz ważniejsze w miarę postępu oczyszczania ze względu na zwiększoną wartość oczyszczonego produktu. Na odzysk mają wpływ procesy destrukcyjne w próbce i niekorzystne warunki na kolumnie.
Rozdzielczość jest osiągana przez selektywność techniki oraz wydajność i selektywność matrycy chromatograficznej w wytwarzaniu wąskich pików. Ogólnie rzecz biorąc, rozdzielczość jest najtrudniejsza do osiągnięcia na końcowych etapach oczyszczania, gdy zanieczyszczenia i białko docelowe mogą mieć bardzo podobne właściwości.
Wybierz technikę, aby spełnić cele etapu oczyszczania.
Wybierz logiczne kombinacje technik oczyszczania w oparciu o główne korzyści techniki i stan próbki na początku lub na końcu każdego etapu.
Przewodnik po przydatności każdej techniki oczyszczania dla etapów w CIPP jest pokazany w Tabeli 9.2.
.Zminimalizuj obsługę próbki między etapami oczyszczania, łącząc techniki, aby uniknąć konieczności kondycjonowania próbki. Produkt powinien być wymywany z pierwszej kolumny w warunkach odpowiednich dla warunków początkowych następnej kolumny (Tabela 9.2).
Siarczan amonu, często używany do klaryfikacji i zatężania próbek (Załącznik 1, Charakterystyka produktów Ni Sepharose, Ni Sepharose excel, TALON Superflow i nienaładowanej IMAC Sepharose), pozostawia próbkę w środowisku o wysokiej zawartości soli. W związku z tym HIC, który wymaga wysokiej zawartości soli w celu zwiększenia wiązania z podłożem chromatograficznym, staje się doskonałym wyborem jako etap wychwytywania. Stężenie soli i całkowita objętość próbki zostaną znacznie zmniejszone po elucji z kolumny HIC. Rozcieńczenie frakcjonowanej próbki lub szybka wymiana buforu przy użyciu kolumny odsalającej przygotuje ją do następnego etapu IEX lub AC.
SEC jest techniką niewiążącą, na którą nie mają wpływu warunki buforowe, ale o ograniczonej objętości. SEC dobrze nadaje się do stosowania po którejkolwiek z technik zatężania (IEX, HIC, AC), ponieważ docelowe białko będzie eluowane w zmniejszonej objętości, a składniki buforu nie będą miały wpływu na proces wykluczania wielkości.
Wybór ostatecznej strategii zawsze będzie zależał od specyficznych właściwości próbki i wymaganego poziomu oczyszczenia. Logiczne kombinacje technik przedstawiono na Rysunku 9.3.
.
Rysunek 9.3. Przykłady logicznych kombinacji etapów chromatografii.
Dla każdego etapu wychwytywania należy wybrać technikę wykazującą najskuteczniejsze wiązanie z białkiem docelowym przy jednoczesnym wiązaniu jak najmniejszej ilości zanieczyszczeń, czyli technikę o najwyższej selektywności i/lub pojemności dla białka docelowego.
Próbka jest oczyszczana przy użyciu kombinacji technik i alternatywnych selektywności. Na przykład, w strategii IEX-HIC-SEC, etap wychwytywania wybiera się zgodnie z różnicami w ładunku (IEX), pośredni etap oczyszczania zgodnie z różnicami w hydrofobowości (HIC), a końcowy etap polerowania zgodnie z różnicami w wielkości (SEC).
Jeśli nic nie wiadomo o białku docelowym, należy użyć IEX-HIC-SEC. Tę kombinację technik można uznać za standardowy protokół.
Rozważ zastosowanie zarówno AIEX, jak i CIEX, aby uzyskać różne selektywności w ramach tej samej strategii oczyszczania.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?