Odsalanie/wymiana buforu i zatężanie w chromatografii powinowactwa znakowanych białek

Desalting w skali laboratoryjnej jest sprawdzoną, prostą i bardzo szybką metodą, która szybko usuwa zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej, jednocześnie przenosząc próbkę do pożądanego buforu w jednym kroku.

Cytiva oferuje szereg gotowych kolumn chromatograficznych i 96-dołkowych płytek filtracyjnych, które mogą być używane ręcznie, razem z systemem chromatograficznym lub w aplikacjach o wysokiej wydajności (Tabela 11.1). Większość tych produktów zawiera Sephadex G-25, pożywkę SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z białek o M_r > 5000. Kolumny PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10 zawierają Sephadex G-10. Te wstępnie zapakowane, jednorazowe kolumny grawitacyjne umożliwiają odsalanie/wymianę buforową mniejszych białek z M_r > 700.

Używaj odsalania/wymiany buforowej w razie potrzeby, przed oczyszczaniem, pomiędzy etapami oczyszczania i/lub po oczyszczaniu. Są to bardzo szybkie metody w porównaniu z dializą, ale należy pamiętać, że każdy dodatkowy krok może zmniejszyć wydajność i że odsalanie rozcieńcza próbkę (protokoły wirowania nie rozcieńczają próbek).

Używaj produktów Sephadex G-25 do usuwania soli i innych związków o niskiej masie cząsteczkowej z białek o M_r > 5000 i produktów Sephadex G-10 do białek (peptydów) o M_r > 700.

Okazjonalnie, oczyszczone frakcje mogą mieć zbyt niskie stężenie białka docelowego i konieczne jest zagęszczenie próbki. Do tego celu nadają się koncentratory próbek Vivaspin^® , które wykonują delikatną, niedenaturującą ultrafiltrację membranową. Omówienie produktów Vivaspin^® znajduje się w dalszej części tego rozdziału.

Desalting ma kilka zalet w porównaniu z dializą. Dializa jest ogólnie powolną techniką, która wymaga dużych objętości buforu i niesie ze sobą ryzyko utraty materiału i aktywności białka docelowego podczas obsługi. Podczas odsalania można przetwarzać próbki o objętości do 30% całkowitej objętości kolumny odsalającej. Wysoka prędkość i wydajność separacji pozwala na szybkie i efektywne przetwarzanie w laboratorium nawet stosunkowo dużych objętości próbek. Stężenie próbki nie ma wpływu na separację, o ile stężenie białek nie przekracza około 70 mg/ml przy użyciu normalnych buforów wodnych i pod warunkiem, że białko docelowe jest stabilne i rozpuszczalne w stosowanym stężeniu. Jeśli wymagane są bufory lotne, należy użyć 100 mM octanu amonu lub 100 mM wodorowęglanu amonu.

Zastanów się, czy warunki próbki można dostosować po prostu przez dodanie lub rozcieńczenie próbki. W przypadku chromatografii powinowactwa (AC) lub chromatografii jonowymiennej (IEX) wystarczające może być dostosowanie pH próbki i, jeśli to konieczne, siły jonowej próbki. Przed chromatografią oddziaływań hydrofobowych (HIC) zwykle dodaje się siarczan amonu i dostosowuje pH.

Rysunek 11.1. Przewodnik wyboru: Wstępnie zapakowane kolumny do odsalania/wymiany buforowej.

Tabela 11.1. Tabela wyboru kolumn odsalających/wymienników buforowych

* W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 0,14 ml zaleca się zastosowanie buforu wyrównawczego o objętości 0,14 ml po całkowitym wchłonięciu próbki.

† W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 0,10 ml zaleca się zastosowanie buforu wyrównawczego o objętości 0,10 ml po całkowitym wchłonięciu próbki.

Odsalanie próbek na małą skalę

† W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 0,10 ml zaleca się zastosowanie buforu wyrównawczego o objętości 0,10 ml po całkowitym wchłonięciu próbki.10 ml po całkowitym wchłonięciu próbki.

Uwagi ogólne

Odsalanie próbek na małą skalę

Dla próbek o objętości od 0.1 do 2,5 ml, możliwe jest równoległe przetwarzanie wielu próbek za pomocą kolumn PD-10 Desalting, PD MidiTrap™ G-25 i PD MiniTrap™ G-25. Dla tych kolumn dostępne są dwa różne protokoły: jeden do użytku ręcznego na stanowisku laboratoryjnym, a drugi do użytku wraz ze standardową wirówką w połączeniu z adapterem spinowym. W przypadku mniejszych białek (peptydów) (M_r > 700) można użyć kolumn PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10.

W przypadku mniejszych objętości próbek, wiele próbek można przeprowadzić na kolumnach wirówkowych PD SpinTrap™ G-25 wraz z mikrowirówką lub na płytce 96-dołkowej PD MultiTrap™ G-25 przy użyciu wirowania do ekstrakcji (rysunek 11.2 A-D). Chociaż jest to możliwe, nie zaleca się stosowania PD MultiTrap™ G-25 z próżnią.

Rysunek 11.2. (A) Przygotowanie próbki PD SpinTrap™ G-25. (B) PD MultiTrap™ G-25. (C i D) Spin Adaptery są używane razem z kolumnami odsalającymi PD-10, PD MidiTrap™ G-25 i PD MiniTrap™ G-25, aby umożliwić ich użycie w standardowej wirówce.

Odsalanie większych objętości próbek za pomocą HiTrap^® i HiPrep™ Kolumny

Połącz szeregowo do trzech kolumn odsalających HiTrap^®, aby zwiększyć pojemność próbki. Na przykład dwie kolumny pozwalają na uzyskanie próbki o objętości 3 ml, a trzy kolumny pozwalają na uzyskanie próbki o objętości 4,5 ml (Tabela 11.1).

Podłącz szeregowo do czterech kolumn odsalających HiPrep™ 26/10, aby zwiększyć pojemność próbki. Na przykład dwie kolumny umożliwiają uzyskanie próbki o objętości 30 ml, a cztery kolumny umożliwiają uzyskanie próbki o objętości 60 ml. Nawet z czterema kolumnami w szeregu, próbka może być przetworzona w ciągu 20 do 30 minut bez problemów z powodu przeciwciśnienia.

Przygotowanie buforu

Wszystkie powszechnie stosowane bufory wodne mogą być używane do odsalania/wymiany buforu. Często wystarczający jest bufor o stężeniu substancji buforującej od 25 do 50 mM. Stężenie soli wynoszące co najmniej 25 mM jest zalecane, aby zapobiec możliwym interakcjom jonowym z medium chromatograficznym. W tym celu często stosuje się chlorek sodu. Przy stężeniu soli powyżej 1 M, substancje hydrofobowe mogą być opóźnione lub mogą wiązać się z medium chromatograficznym. Przy jeszcze wyższych stężeniach soli (1,5 M siarczanu amonu) wypełnienie kolumny kurczy się.

Przygotowanie próbki

Stężenie próbki nie ma wpływu na separację, o ile lepkość nie różni się więcej niż o współczynnik 1,5 od zastosowanego buforu. Odpowiada to maksymalnemu stężeniu 70 mg/ml dla białek, gdy stosowane są normalne, wodne bufory.

Próbka powinna być w pełni rozpuszczona. Odwirować lub przefiltrować (filtr 0,45 µm) bezpośrednio przed załadowaniem, aby usunąć cząstki stałe, jeśli to konieczne.

Wymiana buforu

Rozpuszczalność białka często zależy od pH i/lub siły jonowej (stężenia soli), dlatego wymiana buforu może spowodować wytrącenie białka. Aktywność białka może również zostać utracona, jeśli zmiana pH wykracza poza zakres, w którym białko jest aktywne. Próbki uzyskane po oczyszczeniu będą zwykle wolne od cząstek, chyba że oczyszczone białko lub zanieczyszczenie uległo agregacji.

Protokoły w poniższych sekcjach opisują odsalanie i wymianę buforu przy użyciu różnych formatów wstępnie zapakowanych kolumn.

Odsalanie na małą skalę i wymiana buforu przy użyciu kolumn odsalających PD

Kolumny odsalające PD-10, kolumny PD MidiTrap™ G-25, PD MiniTrap™ G-25, PD SpinTrap™ G-25 i PD MultiTrap™ Kolumny G-25 i 96-dołkowe płytki filtracyjne są wstępnie zapakowane w Sephadex G-25 do grupowego oddzielania substancji o wysokiej (Mr > 5000) od substancji o niskiej masie cząsteczkowej (M_r < 1000) poprzez odsalanie i wymianę buforu. Kolumny PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10 zawierają Sephadex G-10. Te wstępnie zapakowane, jednorazowe kolumny grawitacyjne umożliwiają odsalanie/wymianę buforową mniejszych białek z M_r > 700. Ta kolekcja kolumn i płytek obejmuje zakres objętości próbek od 70 µL do 2,5 ml i umożliwia równoległe przetwarzanie wielu próbek.

PD SpinTrap™ G-25

.

Rysunek 11.3. Kolumny PD SpinTrap™ G-25 to kolumny jednorazowego użytku do szybkiego odsalania i wymiany buforu biomolekuł o Mr > 5000.

PD SpinTrap™ G-25 to kolumna wirówkowa jednorazowego użytku, która została zaprojektowana do szybkiego, wysoce powtarzalnego odsalania i wymiany buforu próbek o objętości od 100 do 180 µL przy użyciu standardowej mikrowirówki (rysunek 11.2 A i 11.3). Kolumny zapewniają wysoce powtarzalne, równoległe odsalanie/wymianę buforu i oczyszczanie próbek białek bez ich rozcieńczania. Kolumny wirówkowe są wstępnie zapakowane w Sephadex G-25 Superfine, medium SEC, które umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z biomolekuł o M_r > 5000.

Każde opakowanie PD SpinTrap™ G-25 zawiera wstępnie zapakowane kolumny i probówki na 50 preparatów.

Bufor
Bufor wyrównawczy: Bufor do wyboru

Procedura usuwania soli

1. Zawiesić podłoże chromatograficzne przez worteksowanie. Odkręć zakrętkę i zdejmij dolne zamknięcie za pomocą plastikowego narzędzia do zdejmowania dolnej zakrętki.
2. Umieść kolumnę w probówce zbiorczej o odpowiednim rozmiarze i usuń roztwór do przechowywania przez wirowanie przez 1 min przy 800 × g.
3. Wyrównać, dodając 400 µL buforu wyrównawczego i wirować przez 1 min przy 800 × g. Odrzucić przepływ i wymienić probówkę zbierającą. Powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy.

Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe znaczenie ma zrównoważenie kolumny wirówkowej za pomocą łącznie 2 ml buforu do równoważenia, aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.

1. Zamień zużytą probówkę zbiorczą na nową czystą probówkę zbiorczą do pobierania próbek.
2. Nałóż powoli od 100 do 180 µL próbki na środek zapakowanej kolumny.
3. Elutuj przez wirowanie przy 800 × g przez 2 minuty.

Odzyskiwanie zależy od rodzaju białka lub innej biomolekuły. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki (np. przy użyciu koncentratora próbek Vivaspin^®) może poprawić odzysk. W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 140 µL zaleca się dodanie buforu wyrównawczego, aby osiągnąć całkowitą objętość 140 µL po całkowitym zaabsorbowaniu próbki w złożu kolumny.

Do odsalania większych objętości próbek należy użyć produktów do oczyszczania i odsalania PD o większej skali lub kolumn HiTrap^® i HiPrep™; patrz Tabela 11.1. Do odsalania wielu próbek należy użyć PD MultiTrap™ G-25.

PD MultiTrap™ G-25

.

Rysunek 11.4. 96-dołkowe płytki PD MultiTrap™ G-25 oferują szybkie, wysoce powtarzalne oczyszczanie biomolekuł o Mr > 5000.

Płytki 96-dołkowe PD MultiTrap™ G-25 są przeznaczone do wysokowydajnego odsalania, wymiany buforu i oczyszczania białek, z wysoką powtarzalnością od dołka do dołka i od płytki do płytki (Rysunek 11.4). Korzystając z 96-dołkowych płytek, można wygodnie i powtarzalnie przeprowadzać równolegle wiele próbek (Rysunek 11.5). PD MultiTrap™ G-25 może być obsługiwany ręcznie lub w trybie automatycznym przy użyciu zrobotyzowanego systemu wyposażonego w urządzenie do wirowania w celu odsolenia lub wymiany buforu próbek o objętości od 70 do 130 µL. W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 100 µL zaleca się zastosowanie buforu wyrównawczego o objętości stosu, aby osiągnąć całkowitą objętość 100 µL po całkowitym wchłonięciu próbki. Elucję można przeprowadzić przez odwirowanie. Chociaż jest to możliwe, nie zaleca się stosowania PD MultiTrap™ G-25 z próżnią ze względu na zmniejszoną powtarzalność w porównaniu z wirowaniem.

Studzienki są wstępnie zapakowane w pożywkę Sephadex G-25, pożywkę SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z biomolekuł o M_r > 5000.

Każde opakowanie PD MultiTrap™ G-25 zawiera cztery wstępnie zapakowane 96-dołkowe płytki, umożliwiające odsalanie lub wymianę buforu do 384 próbek.

Wygodne płytki zbiorcze (po pięć w opakowaniu) są dostępne osobno.

Wygodne płytki zbiorcze (po pięć w opakowaniu) są dostępne osobno.

Rysunek 11.5. Usuwanie NaCl z BSA na 96-dołkowej płytce PD MultiTrap™ G-25 wykazało wysoce powtarzalne wyniki. Średnia wydajność odsalania wyniosła 93%, a odchylenie między dołkami wyniosło 1% (względne odchylenie standardowe).

Protokół wirowania

Bufor
Bufor wyrównawczy: Bufor do wyboru

Procedura odsalania

1. Zawiesić pożywkę chromatograficzną delikatnie potrząsając płytką do góry dnem. Usuń górne i dolne uszczelki i umieść płytkę na płytce zbiorczej.
2. Usuń roztwór do przechowywania przez wirowanie przez 1 min przy 800 × g.
3. Wyrównaj dodając 300 µL buforu do wyrównywania i wiruj przez 1 min przy 800 x g. Odrzuć przepływ i wymień probówkę zbiorczą. Powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy.

Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe znaczenie ma wyrównanie każdego dołka za pomocą łącznie 1,5 ml buforu do wyrównania, aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.

1. Zamień zużytą płytkę do pobierania próbek na nową, czystą płytkę do pobierania próbek.
2. Nałożyć od 70 do 130 µL próbki na środek zapakowanych dołków.
3. Elutować przez wirowanie z prędkością 800 × g przez 2 minuty.

Odzyskiwanie zależy od rodzaju białka lub innej biomolekuły. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki (np. przy użyciu koncentratora próbek Vivaspin^®) może poprawić odzysk. W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 100 µL zaleca się dodanie buforu wyrównawczego, aby osiągnąć całkowitą objętość 100 µL po całkowitym zaabsorbowaniu próbki w złożu kolumny.

Do odsalania większych objętości próbek należy użyć większych produktów do oczyszczania i odsalania PD lub kolumn HiTrap^® i HiPrep™; patrz Tabela 11.1.

PD MiniTrap™ G-25 i PD MidiTrap™ G-25

.

Rysunek 11.6. Wstępnie zapakowane kolumny PD MiniTrap™ G-25 do oczyszczania białek o Mr > 5000 w próbkach o objętości do 500 µL (PD MiniTrap™ G-25; po lewej) i 1,0 ml (PD MidiTrap™ G-25; po prawej).

PD MiniTrap™ G-25 i PD MidiTrap™ G-25 są przeznaczone do wygodnego odsalania i wymiany buforu o objętości od 100 do 500 µL (PD MiniTrap G-25) i od 0 do 0 mL (PD MidiTrap™ G-25).5 do 1,0 ml (PD MidiTrap™ G-25) próbki białka (rysunek 11.6). Kolumny są wstępnie wypełnione pożywką Sephadex G-25, pożywką SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z białek o Mr > 5000. Kolumny te stanowią doskonałą alternatywę dla kolumn PD SpinTrap™ G-25 ze względu na zwiększoną pojemność próbki.

W celu zwiększenia elastyczności, produkty mają dwa alternatywne protokoły aplikacji, wykorzystujące grawitację lub wirowanie. Protokół grawitacyjny umożliwia proste oczyszczanie wielu próbek równolegle bez potrzeby stosowania systemu oczyszczania. Dzięki protokołowi wirowania próbki są przeprowadzane w standardowej wirówce przy minimalnym rozcieńczeniu eluowanej próbki.

Każde opakowanie PD MiniTrap™ G-25 i PD MidiTrap™ G-25 zawiera 50 wstępnie zapakowanych kolumn i cztery adaptery, które są wymagane podczas korzystania z protokołu wirowania.

Protokół grawitacyjny

Bufor

Bufor wyrównawczy: Wybrany bufor

Procedura usuwania soli

1. Zdejmij górną nasadkę i wylej roztwór do przechowywania kolumny. Zdejmij dolną nasadkę.
2. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie dostał się do wypełnionego złoża. Powtórzyć dwukrotnie i odrzucić przepływ.
   Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe jest wyrównanie kolumny za pomocą łącznie 8 ml (PD MiniTrap™ G-25) lub 15 ml (PD MidiTrap™ G-25) buforu wyrównującego, aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
3. Dla PD MiniTrap™ G-25: Dodaj od 100 do 500 µL próbki do kolumny. W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 500 µL należy dodać bufor wyrównawczy, aby dostosować objętość do 500 µL po całkowitym wprowadzeniu próbki do upakowanego złoża.
4. Dla PD MidiTrap™ G-25: Dodaj 0,5 do 1,0 ml próbki do kolumny. W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 1,0 ml należy dodać bufor wyrównawczy, aby dostosować objętość do 1,0 ml po całkowitym wprowadzeniu próbki do wypełnionego złoża.
5. Pozwolić próbce i buforowi wyrównawczemu całkowicie wejść do wypełnionego złoża. Odrzuć przepływ.
6. Umieść probówkę do zbierania próbek pod kolumną i eluuj 1 ml (PD MiniTrap™ G-25) lub 1,5 ml (PD MidiTrap™ G-25) buforu. Zbierz odsoloną próbkę.

Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki (np. przy użyciu koncentratora próbek Vivaspin^®) może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe w przypadku stosowania przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem. Typowy wynik odsalania białka za pomocą PD MiniTrap™ G-25 przedstawiono na Rysunku 11.7.

.

Rysunek 11.7. Usuwanie NaCl z BSA przy użyciu protokołu grawitacyjnego. Odzysk białka wyniósł 95%.

Protokół wirowania

Bufor

Bufor wyrównawczy: Bufor do wyboru

Procedura usuwania soli

1. Zdejmij górną nasadkę i wylej roztwór do przechowywania kolumny.
2. Zdejmij górny filtr za pomocą kleszczyków.
3. Umieść kolumnę w probówce o pojemności 15 ml (PD MiniTrap™ G-25) lub 50 ml (PD MidiTrap™ G-25) i podłącz dostarczony adapter kolumny do górnej części probówki.
4. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie dostał się do wypełnionego złoża. Powtórzyć i odrzucić przepływający bufor.
5. Ponownie napełnić kolumnę buforem wyrównawczym i odwirować przy 1000 x g przez 2 minuty, a następnie odrzucić przepływający bufor.
   Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe znaczenie ma wyrównanie kolumny za pomocą łącznie 8 ml (PD MiniTrap™ G-25) lub 15 ml (PD MidiTrap™ G-25) buforu wyrównującego (kroki 4 i 5) w celu całkowitego usunięcia roztworu do przechowywania.
6. Dla PD MiniTrap™ G-25: Dodaj powoli od 200 do 500 µl próbki na środek upakowanego złoża. Dla PD MidiTrap™ G-25: Dodaj powoli 0,75 do 1,0 ml próbki do środka wypełnionego złoża.
7. Umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml (PD MiniTrap™ G-25) lub 50 ml (PD MidiTrap™ G-25).
8. Rozcieńczyć przez wirowanie 1000 × g przez 2 minuty i zebrać eluat.

Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki (np. przy użyciu koncentratora próbek Vivaspin^®) może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.

Do odsalania większych objętości próbek należy użyć kolumn HiTrap^® i HiPrep™; patrz Tabela 11.1.

Kolumny odsalające PD-10

Kolumny odsalające PD-10 są przeznaczone do wygodnego odsalania i wymiany buforu o objętości od 1.0 do 2,5 ml próbki białka. Kolumny są wstępnie wypełnione pożywką Sephadex G-25, pożywką SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z białek o M_r > 5000. Kolumny te stanowią doskonałą alternatywę dla kolumn PD MidiTrap™ G-25 ze względu na zwiększoną pojemność próbki.

W celu zwiększenia elastyczności, produkt ma dwa alternatywne protokoły aplikacji, wykorzystujące grawitację lub wirowanie. Protokół grawitacyjny umożliwia proste oczyszczanie wielu próbek równolegle bez potrzeby stosowania systemu oczyszczania. Korzystając z protokołu wirowania, próbki są uruchamiane w standardowej wirówce przy minimalnym rozcieńczeniu eluowanej próbki.

Każde opakowanie kolumn odsalających PD-10 zawiera 30 wstępnie zapakowanych kolumn. Aby uprościć korzystanie z kolumn odsalających PD-10 z protokołem grawitacyjnym, można użyć zbiornika buforowego LabMate PD-10. Korzystając ze zbiornika buforowego, bufory płuczące i wyrównujące mogą być stosowane w jednym kroku.

Typowy rozdział pokazano na Rysunku 11.8.

Rysunek 11.8. Usuwanie NaCl z roztworu albuminy. Kolumna odsalająca PD-10 została zrównoważona wodą destylowaną. Łącznie odzyskano 23,8 mg albuminy w 3,5 ml eluentu, co odpowiada wydajności 95,3% (między strzałkami).

Protokół grawitacyjny

Bufor

Bufor wyrównawczy: Wybrany bufor

Procedura usuwania soli

1. Odetnij dolną końcówkę, zdejmij górną nasadkę i wylej nadmiar płynu.
2. Jeśli jest dostępny, zamontuj zbiornik buforowy LabMate na górze kolumny odsalającej PD-10 i umieść kolumny w urządzeniu PD-10 Desalting LabMate.
3. Wyrównaj kolumnę za pomocą około 25 ml buforu. Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe jest wyrównanie kolumny za pomocą 25 ml buforu wyrównującego, aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
4. Dodaj próbkę o łącznej objętości 2,5 ml. Jeśli próbka jest mniejsza niż 2,5 ml, dodaj bufor, aż do uzyskania całkowitej objętości 2,5 ml. Odrzucić wypływ.
5. Upuścić 3,5 ml buforu i zebrać wypływ.

Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki (np. przy użyciu koncentratora próbek Vivaspin^®) może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.

Do odsalania większych objętości próbek należy użyć kolumn HiTrap^® i HiPrep™; patrz Tabela 11.1.

Protokół wirowania

Bufor

Bufor wyrównawczy: Bufor do wyboru

Procedura usuwania soli

1. Zdejmij górną nasadkę i wylej roztwór do przechowywania kolumny.
2. Zdejmij górny filtr za pomocą kleszczyków. Zdejmij dolną pokrywę.
3. Umieść kolumnę odsalającą PD-10 w probówce zbiorczej o pojemności 50 ml i podłącz dostarczony adapter kolumny do górnej części probówki.
4. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie dostał się do upakowanego złoża. Powtórzyć trzykrotnie, za każdym razem odrzucając przepływający bufor.
5. Napełnić kolumnę ponownie buforem wyrównawczym i odwirować przy 1000 x g przez 2 minuty, a następnie odrzucić przepływający bufor.
6. Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe jest wyrównanie kolumny za pomocą łącznie 25 ml buforu wyrównawczego (kroki 4 i 5), aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
7. Dodaj powoli 1,75 do 2,5 ml próbki do środka wypełnionego złoża.
8. Umieść kolumnę odsalającą PD-10 w nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml.
9. Elutuj przez wirowanie 1000 × g przez 2 minuty i zbierz eluat.

Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki (np. przy użyciu koncentratora próbek Vivaspin^®) może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.

Do odsalania większych objętości próbek należy użyć kolumn HiTrap^® i HiPrep™; patrz Tabela 11.1.

PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10

PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10 są przeznaczone do wygodnego odsalania i wymiany buforu o objętości od 100 do 300 µL (PD MiniTrap™ G-10) lub od 0,4 do 0,0 ml (PD MidiTrap™ G-10).4 do 1,0 ml (PD MidiTrap™ G-10) próbki białka (rysunek 11.9). Kolumny są wstępnie wypełnione pożywką Sephadex G-10, pożywką SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z białek o M_r > 700. Każde opakowanie PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10 zawiera 50 wstępnie zapakowanych kolumn.

Rysunek 11.9. Kolumny PD MidiTrap™ G-10 (po lewej) i PD MiniTrap™ G-10 (po prawej) są wstępnie zapakowane w Sephadex G-10.

Protokół grawitacyjny

Bufor

Bufor wyrównawczy: Bufor do wyboru

Procedura odsalania

1. Zawiesić pożywkę, wstrząsając kolumną. Poczekaj, aż pożywka opadnie. Zdejmij górną i dolną pokrywę i pozwól, aby roztwór do przechowywania wypłynął.
2. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie dostał się do wypełnionego złoża. Powtórz dwukrotnie i wyrzuć wypływający roztwór.
3. Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe jest wyrównanie kolumny za pomocą 8 ml (PD MiniTrap™  G-10) lub 16 ml (PD MidiTrap™ G-10) buforu wyrównującego, aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
4. Dla PD MiniTrap™ G-10: Dodaj maksymalnie 300 µL próbki do kolumny. Dodaj bufor wyrównawczy, aby dostosować objętość do 700 µL po całkowitym wprowadzeniu próbki do upakowanego złoża.
5. Dla PD MidiTrap™ G-10: Dodaj maksymalnie 1,0 ml próbki do kolumny. Dodaj bufor wyrównawczy, aby dostosować objętość do
   1,7 ml po całkowitym wprowadzeniu próbki do wypełnionego złoża.
6. Pozwól próbce i buforowi wyrównawczemu całkowicie wejść do wypełnionego złoża. Odrzuć przepływ.
7. Umieść probówkę do zbierania próbek pod kolumną i eluuj za pomocą 0,5 ml (PD MiniTrap™ G-10) lub 1,2 ml
   (PD MidiTrap™ G-10) buforu. Zbierz odsoloną próbkę.

.

Rysunek 11.10. Usuwanie NaCl z roztworu neurotensyny (13-aminokwasowego neuropeptydu). Odzysk neurotensyny wynosił 81%, a zdolność odsalania 84% (między strzałkami) dla PD MiniTrap™ G-10 (A i B). W przypadku PD MidiTrap™ G-10 (C i D) odzysk neurotensyny wynosił 79%, a zdolność odsalania 91% (między strzałkami). Odzysk obliczono na podstawie pomiaru absorbancji przy 215 nm, a zdolność odsalania zmierzono na podstawie przewodności. Wykresy B i D pokazują odzysk neurotensyny i usuwanie soli w porównaniu z całkowitą objętością elucji na kolumnie, odpowiednio dla PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10.

HiTrap^® Kolumny odsalające

Rysunek 11.11. Kolumna odsalająca HiTrap® umożliwia wydajne, łatwe do przeprowadzenia rozdzielanie grup za pomocą strzykawki, pompy lub systemu chromatograficznego.

HiTrap^® Desalting to kolumna o pojemności 5 ml (Rysunek 11.11) wypełniona podłożem SEC Sephadex G-25 Superfine, opartym na usieciowanych kulkach dekstranowych. Zakres frakcjonowania białek globularnych wynosi od M_r 1000 do 5000, z granicą wykluczenia około M_r 5000. Zapewnia to grupowe oddzielanie białek/peptydów większych niż M_r 5000 od cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej niż M_r 1000.

HiTrap^® Desalting może być stosowany z roztworami wodnymi w zakresie pH od 2 do 13. Zapakowany nośnik jest stabilny we wszystkich powszechnie stosowanych buforach, roztworach mocznika (8 M), Gua-HCl (6 M) i wszystkich niejonowych i jonowych detergentach. Niższe alkohole (metanol, etanol, propanol) mogą być stosowane w buforze lub próbce, ale zalecamy, aby ich stężenie nie przekraczało 25% v/v. Należy unikać długotrwałej ekspozycji (godziny) na pH poniżej 2 lub powyżej 13 lub na środki utleniające.

Zalecany zakres objętości próbek wynosi od 0,1 do 1,5 ml, gdy pożądane jest całkowite usunięcie składników o niskiej masie cząsteczkowej. Szybkość przepływu w zakresie od 1 do 10 ml/min nie ma wpływu na separację. Maksymalna zalecana szybkość przepływu wynosi 15 ml/min. Separacje można łatwo przeprowadzić za pomocą strzykawki, pompy lub systemu chromatograficznego. Maksymalnie trzy kolumny mogą być połączone szeregowo, co pozwala na obsługę większych objętości próbek. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, kolumny należy używać tylko z tym samym typem próbki.

Rysunek 11.12 przedstawia typową separację odsalania i wymiany buforu uzyskaną przy użyciu HiTrap^® Desalting i monitorowaną przez śledzenie zmian absorpcji UV i przewodności.

Rysunek 11.12. Wysoce wydajne odsalanie w 30 s przy użyciu HiTrap® Desalting.

Bufor

Bufor wyrównawczy: Bufor do wyboru

Równoważenie kolumny

1. Napełnij strzykawkę lub rurkę pompy buforem. Zdejmij zatyczkę. Aby uniknąć wprowadzenia powietrza do kolumny, podłącz kolumnę "kropla w kroplę" do strzykawki (przez złącze) lub do rurki pompy.
2. Usuń zatrzask na wylocie kolumny.
3. Płucz kolumnę 25 ml buforu z prędkością 5 ml/min, aby całkowicie usunąć bufor do przechowywania, który zawiera 20% etanolu¹. Jeśli w kolumnie uwięzione jest powietrze, należy przemywać ją odgazowanym buforem, aż powietrze zniknie. Powietrze wprowadzone do kolumny przypadkowo podczas aplikacji próbki nie wpływa na separację.

¹  5 ml/min odpowiada około 120 kroplom/min przy użyciu kolumny HiTrap^® 5 ml.

Ręczne odsalanie za pomocą strzykawki

1. Aby obsługiwać kolumnę za pomocą strzykawki, podłącz strzykawkę do kolumny za pomocą dostarczonego złącza.
2. Wyrównać kolumnę; patrz poprzednia strona, Wyrównywanie kolumny.
3. Nałożyć próbkę za pomocą strzykawki o pojemności od 2 do 5 ml z szybkością przepływu od 1 do 10 ml/min¹. Wyrzucić ciecz eluowaną z kolumny. Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 1,5 ml, zmień bufor i kontynuuj wstrzykiwanie, aż do wymycia łącznie 1,5 ml. Wyrzucić wymytą ciecz.
4. Odsolić białko odpowiednią objętością wybraną z tabeli 11.2. Zebrać odsolone białko.

¹  5 ml/min odpowiada około 120 kroplom/min przy użyciu kolumny HiTrap^® 5 ml.

Maksymalna zalecana objętość próbki przy użyciu jednej kolumny HiTrap^® Desalting 5 mL wynosi 1,5 mL. Patrz Tabela 11.2 w celu uzyskania informacji na temat stosowania mniejszych objętości próbek.

Tabela 11.2 Zalecane objętości próbki i elucji przy użyciu HiTrap® Desalting ze strzykawką, z przykładami typowych wydajności i pozostałej soli w odsolonej próbce.

Załadunek próbki (mL)	Dodanie buforu (mL)	Elucja i pobranie (mL)	Wydajność (%)	Pozostała sól (%)	Współczynnik rozcieńczenia
0.25	1.25	1.0	> 95	0.0	4.0
0.50	1.0	1.5	> 95	< 0.1	3.0
1.00	0.5	2.0	> 95	< 0.2	2.0
1.50	0.0	2.0	> 95	< 0.2	1.3

Pusta objętość kolumny wynosi 1,5 ml. Składniki o wysokiej masie cząsteczkowej eluują między 1,5 a 4,5 ml, w zależności od objętości próbki. Składniki o niskiej masie cząsteczkowej zaczynają eluować po 3,5 ml.

Niektóre rodzaje cząsteczek, takie jak małe heterocykliczne lub homocykliczne związki aromatyczne (puryny, pirymidyny, barwniki) mogą wchodzić w interakcje z Sephadexem i dlatego są eluowane później niż oczekiwano. W takich przypadkach można użyć większych objętości próbek, ale separacja musi być zoptymalizowana dla każdego rodzaju zanieczyszczającego związku.

Desalting Using a Pump

1. Equilibrate the column: see Column equilibration above.
2. Apply up to 1.5 mL of sample. Monitoruj płyn z kolumny za pomocą monitora UV i/lub monitora przewodności. Utrzymuj szybkość przepływu w zakresie od 1 do 10 ml/min. Zebrać frakcje.
3. Rozcieńczyć kolumnę około 10 ml buforu przed nałożeniem następnej próbki. Zebrać frakcje.

Skalowanie odsalania z HiTrap^® do HiPrep™ Desalting

Dla rozdzielania próbek o objętości większej niż 1.5 ml lub w celu zwiększenia rozdzielczości między składnikami o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej, można łatwo połączyć szeregowo do trzech kolumn odsalających HiTrap^®. W przypadku operacji strzykawkowych objętości sugerowane w Tabeli 11.2 powinny być proporcjonalnie zwiększone, a zalecana szybkość przepływu utrzymana.

Rozcieńczenie próbki zależy od objętości próbki i liczby kolumn używanych szeregowo. Można uzyskać niższe współczynniki rozcieńczenia niż te zaproponowane w Tabeli 11.2 ale objętości elucji muszą być zoptymalizowane dla każdej kombinacji objętości próbki i liczby kolumn w szeregu. Ciśnienie wsteczne dla każdej kolumny wynosi około 0,25 bara przy 10 ml/min.

HiPrep™ 26/10 Desalting jest wypełniony Sephadexem G-25 Fine. Zapewnia grupowe oddzielanie substancji o wysokiej (M_r > 5000) od substancji o niskiej masie cząsteczkowej (M_r < 1000), umożliwiając niezawodne i powtarzalne odsalanie i wymianę buforu przy wielkości próbki 15 ml na kolumnę. Od dwóch do czterech kolumn może być używanych szeregowo (Tabela 11.1) dla próbek o objętości od 30 do 60 ml.

Stężenie próbki białka

Rysunek 11.13. Koncentratory próbek Vivaspin® zapewniają nawet 30-krotne stężenie próbki z odzyskiem docelowej cząsteczki zazwyczaj przekraczającym 95%.

Koncentratory próbek Vivaspin^® są przeznaczone do szybkiego, niedenaturującego zatężania próbek biologicznych za pomocą ultrafiltracji membranowej. Możliwe jest osiągnięcie nawet 30-krotnego stężenia próbki z odzyskiem docelowej cząsteczki zazwyczaj przekraczającym 95%. Cały proces przeprowadzany jest w pojedynczej probówce z górną komorą zawierającą próbkę i dolną komorą oddzieloną półprzepuszczalną membraną o masie cząsteczkowej (MWCO) wybranej przez użytkownika. Wirowanie jest stosowane w celu wtłoczenia rozpuszczalnika przez membranę, pozostawiając bardziej skoncentrowaną próbkę w górnej komorze.

Koncentratory próbek Vivaspin^® mogą być używane z próbkami o objętości od 100 µL do 20 ml, z zakresem wartości MCWO od M_r 3000 do 100 000. Wszystkie produkty są dostępne z wartościami MCWO 3000, 5000, 10 000, 30 000, 50 000 i 100 000 (Tabela 11.3).

Tabela 11.3 Kolumny Vivaspin® i zakresy objętości próbek

Produkt	Zakres objętości próbki
Vivaspin® 500 Vivaspin® 2 Vivaspin® 6 Vivaspin® 20	100 do 500 µL 400 µL do 2 mL 2 do 6 mL 5 do 20 mL

1. Wybierz najbardziej odpowiednią membranę odcinającą dla próbki. Aby uzyskać maksymalny odzysk, wybierz MWCO co najmniej 50% mniejsze niż wielkość cząsteczkowa interesującego gatunku.
2. Napełnij koncentrator do maksymalnej objętości podanej w Załączniku 12 (Tabele dla koncentratorów próbek Vivaspin^®), Tabela A12.1.
   (Upewnij się, że pokrywa jest całkowicie osadzona.)
3. Włóż zmontowany koncentrator do wirówki.
   Uwaga: W przypadku korzystania z rotora o stałym kącie nachylenia należy ustawić koncentrator pod takim kątem, aby okienko z nadrukiem było skierowane do góry/na zewnątrz.
4. Ustaw prędkość wirowania zgodnie z zaleceniami podanymi w Załączniku 12 (Tabele dla koncentratorów próbek Vivaspin^®), Tabela A12.2, uważając, aby nie przekroczyć wskazanej maksymalnej siły g.
5. Ustaw czas wirowania (czas koncentracji) po zapoznaniu się z Dodatkiem 12 (Tabele dla Vivaspin^® koncentratorów próbek), Tabela A12.3 do Tabela A12.6 dla typowych odzysków dla różnych kombinacji białek, produktów Vivaspin^® i filtrów.
6. Skoncentrować próbki stosując prędkość wirowania i czas ustawione w krokach 4 i 5.
7. Zdjąć zespół i odzyskać próbkę z dna kieszeni koncentratora za pomocą pipety. Probówkę z koncentratem można zamknąć w celu przechowywania.