Oczyszczanie lub usuwanie białek wiążących DNA

Heparin Sepharose, Heparin Sepharose 6 Fast Flow, Capto Heparin

Białka wiążące DNA tworzą niezwykle zróżnicowaną klasę białek, które łączy jedna cecha, ich zdolność do wiązania się z DNA. Funkcjonalnie grupę tę można podzielić na te odpowiedzialne za replikację i orientację DNA, takie jak histony, nukleosomy i replikazy oraz te zaangażowane w transkrypcję, takie jak polimerazy RNA/DNA, aktywatory i represory transkrypcji oraz enzymy restrykcyjne. Mogą być wytwarzane jako znakowane białka, aby umożliwić bardziej specyficzne oczyszczanie, ale ich zdolność do wiązania DNA umożliwia również specyficzne grupowo oczyszczanie przy użyciu heparyny jako liganda. Heparyna jest wysoce sufonowanym glikozaminoglikanem o zdolności wiązania bardzo szerokiego zakresu biomolekuł, w tym:

• Białka wiążące DNA, takie jak czynniki inicjacji, czynniki elongacji, endonukleazy restrykcyjne, ligazy DNA, polimerazy DNA i RNA.
• Inhibitory proteaz serynowych, takie jak antytrombina III, nexiny proteazowe.
• Enzymy, takie jak proteazy komórek tucznych, lipaza lipoproteinowa, enzymy krzepnięcia, dysmutaza ponadtlenkowa.
• Czynniki wzrostu, takie jak czynnik wzrostu fibroblastów, czynnik wzrostu komórek Schwanna, czynnik wzrostu komórek śródbłonka.
• Białka macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak fibronektyna, witronektyna, laminina, trombospondyna, kolageny.
• Receptory hormonów, takie jak receptory estrogenów i androgenów.
• Lipoproteiny.

Strukturę heparyny przedstawiono na rysunku 3.10. Heparyna ma dwa tryby interakcji z białkami i w obu przypadkach interakcja może być osłabiona przez wzrost siły jonowej.

1. W interakcji z białkami wiążącymi DNA heparyna naśladuje polianionową strukturę kwasu nukleinowego.
2. W swoich interakcjach z czynnikami krzepnięcia, takimi jak antytrombina III, heparyna działa jako ligand powinowactwa.

Rysunek 3.10. Struktura polisacharydu heparyny składającego się z naprzemiennych reszt kwasu heksuronowego (A) i D-glukozaminy (B). Kwas heksuronowy może być kwasem D-glukuronowym (u góry) lub jego epimerem C-5, kwasem L-iduronowym (u dołu). R1 = -H lub -SO3-, R2 = -SO3- lub -COCH3.

Charakterystyka mediów chromatograficznych

Charakterystykę mediów chromatograficznych do oczyszczania lub usuwania białek wiążących DNA przedstawiono w tabeli 3.11.

.

Tabela 3.11 Charakterystyka nośników do chromatografii Heparin Sepharose i Capto Heparin

	Gęstość ligandu (mg/ml)	Skład	Stabilność pH1	Średni rozmiar cząstek (µm)	Średni rozmiar cząstek (µm)	Stabilność pH1	Średni rozmiar cząstek (µm)
Heparin Sepharose High Performance	10	Heparyna połączona z Sepharose High Performance poprzez aminowanie redukcyjne w celu uzyskania stabilnego przyłączenia nawet w warunkach alkalicznych.	Krótkoterminowy: 5 do 10 Długoterminowy: 5 do 10	34
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	5.0	Heparyna sprzężona z Sepharose 6 Fast Flow poprzez aminowanie redukcyjne w celu zapewnienia stabilnego przyłączenia nawet w warunkach alkalicznych.	Krótkoterminowy: 4 do 13 Długoterminowy: 4 do 12	90
Capto Heparin	1.8	Heparyna sprzężona z Capto	Krótkoterminowo: od 4 do 13 Długoterminowo: od 4 do 12	90

¹ Krótkoterminowy odnosi się do przedziału pH dla procedur regeneracji, czyszczenia na miejscu i odkażania. Długoterminowy odnosi się do przedziału pH, w którym pożywka jest stabilna przez długi okres czasu bez niekorzystnego wpływu na jej późniejszą wydajność chromatograficzną.

Opcje pH

Opcje pH dla pożywki chromatograficznej Heparin Sepharose 6 Fast Flow i kolumn w opakowaniach jednostkowych, a także Capto Heparin przedstawiono w tabeli 3.12.

Tabela 3.12 Opcje oczyszczania białek wiążących DNA

	Wydajność wiązania	Maksymalny przepływ roboczy	Komentarze1
HiTrap® Heparin HP, 1 mL	Antytrombina bydlęca III, 3 mg/kolumna	4 mL/min	Opakowana kolumna 1 mL
HiTrap® Heparin HP, 5 mL	antytrombina bydlęca III, 15 mg/kolumna	20 mL/min	Wstępnie zapakowana kolumna 5 mL
HiPrep Heparin FF 16/10	Bovine antithrombin III, 40 mg/kolumna	10 mL/min	Prepacked 20 mL column.
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	Antytrombina bydlęca III, podłoże 2 mg/ml	400 cm/h1	Dostarczana jako zawiesina gotowa do pakowania w kolumnie.
Capto Heparin	Antytrombina III, 1.4 mg/ml podłoża	700 cm/h2	Dostarczana jako zawiesina gotowa do pakowania w kolumny

¹ Patrz Załącznik 4 do konwersji prędkości przepływu (cm/h) na objętościową szybkość przepływu (ml/min). Maksymalny przepływ roboczy jest obliczany na podstawie pomiaru w kolumnie z wypełnieniem o wysokości złoża 10 cm i średnicy wewnętrznej 5 cm.

² Kolumna o średnicy 1 m, wysokość złoża 20 cm.

Przykłady oczyszczania

Rysunki 3.11 do 3.13 przedstawiają przykłady warunków stosowanych do oczyszczania różnych białek wiążących DNA.

Rysunek 3.11. Częściowe oczyszczanie rekombinowanej odwrotnej transkryptazy HIV na Hi Trap Heparin HP

Rysunek 3.12. Częściowe oczyszczenie rekombinowanego białka Oct-1 wiążącego DNA (dzięki uprzejmości dr Gunnara Westina, Szpital Uniwersytecki, Uppsala, Szwecja) przy użyciu HiTrap® Heparin HP, 5 ml.

Rysunek 3.13. Oczyszczanie scCro8 na HiPrep Heparin FF 16/10.

Wykonywanie separacji

Heparin Sepharose 6 Fast Flow, Heparin Sepharose High Performance

Bufor wiążący:	20 mM Tris-HCl, pH 8.0 lub 10 mM fosforan sodu, pH 7.0
Bufor elucyjny:	20 mM Tris-HCl, 1 do 2 M NaCl, pH 8.0 lub 10 mM fosforan sodu, 1 do 2 M NaCl, pH 7.0

1. Wyrównać kolumnę za pomocą 10 CV buforu wiążącego.
2. Nałożyć próbkę.
3. Płukać za pomocą 5 do 10 CV buforu wiążącego lub do momentu, gdy w eluencie nie pojawi się żaden materiał (monitorowany przez absorpcję UV przy A280 nm).
4. Elucja za pomocą 5 do 10 CV buforu elucyjnego przy użyciu ciągłego lub stopniowego gradientu od 0% do 100% buforu elucyjnego.

Modyfikuj selektywność heparyny poprzez zmianę pH lub siły jonowej buforów. Elucja przy użyciu ciągłego lub stopniowego gradientu z NaCl, KCl lub (NH4)2SO4 do 2 M.

W przypadku stosowania do oczyszczania lub usuwania czynników krzepnięcia:

Ponieważ heparyna działa jako ligand powinowactwa dla czynników krzepnięcia, zaleca się dodanie minimalnego stężenia 150 mM NaCl w buforze wiążącym.

Jeśli rosnący gradient soli daje niezadowalające wyniki, należy użyć heparyny (1 do 5 mg/ml) jako czynnika konkurującego w buforze elucyjnym.

Oczyszczanie

Usuń jonowo związane białka przez płukanie 0.5 CV 2 M NaCl przez 10 do 15 min.

Usuń wytrącone lub zdenaturowane białka przez przemywanie 4 CV 100 mM NaOH przez 1 do 2 h; lub 2 CV 6 M chlorowodorku guanidyny przez 30 do 60 min; lub 2 CV 8 M mocznika przez 30 do 60 min. Usunąć hydrofobowo związane białka przez przemywanie 4 CV 0,1% do 0,5% Tween 20 przez 1 do 2 h.

Stabilność chemiczna

100 mM NaOH (1 W w 20 °C), 50 mM octan sodu, pH 4,0, 4 M NaCl, 8 M mocznik, 6 M chlorowodorek guanidyny.

Przechowywanie

Przepłukać nośniki chromatograficzne i kolumny 50 mM octanem sodu zawierającym 20% etanolu (użyć około 5 CV dla zapakowanych nośników) i przechowywać w temperaturze od 4 °C do 8 °C.

Capto Heparin

.

Bufor wiążący:	100 mM Tris-HCl, 10 mM cytrynian trisodowy, 225 mM NaCl, pH 7.4
Bufor płuczący:	100 mM Tris-HCl, 10 mM cytrynian trisodowy, 330 mM NaCl, pH 7.4
Bufor elucyjny:	100 mM Tris-HCl, 10 mM cytrynian trisodowy, 2 M NaCl, pH 7,4

1. Ekilibrować za pomocą 5 CV buforu wiążącego.
2. Nałożyć próbkę.
3. Krok płukania 1: płukanie za pomocą 40 CV buforu wiążącego.
4. Krok płukania 2: płukanie za pomocą 15 CV buforu płuczącego.
5. Elucja za pomocą 9,5 CV buforu elucyjnego.

Szybkość przepływu 0,5 ml/min jest zalecana dla kolumny o pojemności 1 ml.

Czyszczenie

Substancje takie jak zdenaturowane białka, które nie ulegają elucji podczas regeneracji, można usunąć za pomocą procedur czyszczenia na miejscu (CIP). Zalecana procedura CIP dla Capto Heparin to 4 CV 100 mM NaOH z czasem kontaktu od 1 do 2 godzin.

Przechowywanie

Nieużywane nośniki chromatograficzne należy przechowywać w temperaturze od 4ºC do 30ºC w 20% etanolu i 50 mM octanie sodu.

Nieużywane nośniki chromatograficzne należy przechowywać w temperaturze od 4ºC do 30ºC w 20% etanolu i 50 mM octanie sodu.