Oczyszczanie przeciwciał przy użyciu agarozy Protein A/G/L

Ten protokół został zaprojektowany jako szybka metoda oczyszczania przeciwciał z surowic ssaków, wodobrzusza i supernatantów hodowli komórkowych. Należy zauważyć, że jeśli materiałem wyjściowym jest surowica lub wodobrzusze, końcowy preparat będzie zawierał endogenne IgG gospodarza, a także specyficzne przeciwciała. Ogólnie rzecz biorąc, obecność tych endogennych IgG nie powinna zakłócać testów z użyciem przeciwciał. Zawartość immunoglobulin w normalnych surowicach od kilku gatunków i ze źródeł przeciwciał monoklonalnych podano w Tabeli (PDF).

Uwaga: Oferujemy PURE1A Kit do oczyszczania przeciwciał przy użyciu białka A.

Protokół oczyszczania
Odczynniki i sprzęt
Procedura

Protokół oczyszczania (dla kolumny 1 mL)

Uwagi: Protokół ten wykorzystuje bufor ładujący o wysokiej molarności i wysokim pH dla białka A w celu zwiększenia wiązania podklas o słabym powinowactwie do białka A (takich jak mysie IgG1). Wiązanie z białkiem G i L zachodzi przy neutralnym pH, więc jako bufor ładujący stosuje się sól fizjologiczną buforowaną fosforanami. Elucja związanej Ig odbywa się w jednym etapie za pomocą buforu cytrynianowego o pH 3, który usuwa wszystkie podklasy, które związały się z żywicą. Zdolność białka A i białka G dla IgG z różnych gatunków można oszacować na podstawie względnego powinowactwa podanego w Tabeli (PDF). Podklasa IgG z 1-2 plusami będzie wiązać 1-5 mg IgG na ml żywicy. Podklasa z 3-4 plusami będzie wiązać 10-25 mg na ml żywicy. Białko L jest w stanie wiązać wszystkie klasy Ig i może wiązać 3-10 mg Ig na ml żywicy dla gatunków z 4 plusami. Zaleca się, aby używana żywica miała co najmniej 2 plusy dla gatunku i klasy Ig oczyszczanego materiału.

Odczynniki i sprzęt

1. Surowica, wodobrzusze lub supernatant hodowli komórkowej
2. Bufor ładujący białko A: 1 M fosforan potasu, pH 9,0
3. Bufor ładujący białko G lub L: 0,01 M sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), pH 7,4 (Nr produktu P4417)
4. Bufor elucyjny: 0,1 M kwas cytrynowy, pH 3,0
5. 1,5 M zasada Tris, do neutralizacji eluatu
6. 3 - 5 mL strzykawka (tuleja kolumny), wata szklana
7. Stopcock, Luer-Lock (Nr produktu. S7396)
8. Statyw pierścieniowy, zacisk
9. Próbówki, stojak
10. Spektrofotometr, kuwety
11. Miernik pH
12. Pipety transferowe, żarówki
13. Zlewki, mieszadła i płytka mieszająca (do przygotowania buforu)
14. Jałowe filtry (opcjonalnie)
15. Azydek sodu (środek konserwujący) (Nr produktu. S2002)
    

Procedure

1. Przygotować bufory. Bufory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie. Filtracja przez sterylne filtry przedłuży żywotność buforów, ale nie jest wymagana.
2. Przygotuj tuleję kolumny. Wyjmij tłok ze strzykawki i wyrzuć go. Wciśnij niewielką ilość waty szklanej na dno strzykawki, wystarczającą do utworzenia poduszki o grubości około 1/2 - 1 cm. Zamocować zawór odcinający. Przepłukać 1-2 ml buforu obciążającego. Upewnij się, że poduszka z waty szklanej pozostaje mocno na dnie strzykawki.
3. Zawiesić żywicę w 2 ml buforu ładującego, odwracając i obracając butelkę. Unikaj nadmiernego wstrząsania. Nie worteksuj zawiesiny.
4. Wlej zawiesinę do strzykawki. Pozwól, aby nadmiar buforu spłynął, a następnie przepłucz kolumnę 5 ml buforu ładującego. Nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia żywicy.
5. Jeśli to możliwe, oszacować ilość Ig w surowicy, wodobrzuszu lub supernatancie, który ma zostać załadowany. Jeśli ilość Ig nie jest znana, Tabela (PDF) zawiera przybliżone poziomy Ig w surowicy różnych gatunków, w wodobrzuszu myszy i w supernatancie hodowli komórkowej, które można wykorzystać do oszacowania ilości Ig w materiale wyjściowym. W oparciu o pojemność żywicy dla Ig z gatunku materiału wyjściowego (patrz Uwagi powyżej) i ilość Ig w materiale wyjściowym, oblicz objętość do załadowania.
   
   Uwaga: Są to wartości przybliżone, które należy stosować jedynie jako wstępną wskazówkę. Rzeczywiste stężenia Ig w płynach i wiązanie z żywicami będą się różnić, a optymalne proporcje materiału wyjściowego do żywicy należy określić doświadczalnie.
   
   
6. Rozcieńczyć surowicę lub wodobrzusze 3 objętościami buforu ładującego. Rozcieńczyć supernatant 1 objętością buforu obciążającego.
7. Nałożyć rozcieńczony materiał na kolumnę. Zebrać niezwiązaną frakcję do probówki lub zlewki i zachować do ewentualnego ponownego przetworzenia. Przemyć niezwiązane białka za pomocą 5 ml buforu obciążającego na ml żywicy.
8. Nałożyć bufor elucyjny na kolumnę. Zebrać frakcje równe 1/2 objętości kolumny. Użyj 10 ml buforu elucyjnego na ml żywicy.
9. Re-kalibruj kolumnę za pomocą 5 ml buforu ładującego na ml żywicy. Sprawdź pH wypływu, aby upewnić się, że kolumna jest zrównoważona przy pH buforu ładującego.
10. Przeprowadź test frakcji eluatu na obecność białka przez absorbancję przy 280 nm. (W razie potrzeby wizualne oznaczenie można wykonać przy użyciu zestawu Total Protein Kit.)
11. Zbierz frakcje, które są pozytywne dla białka. Zneutralizować do pH 6 - 8 za pomocą 1,5 M zasady Tris.
12. W razie potrzeby niezwiązana frakcja może zostać ponownie nałożona na kolumnę w celu odzyskania Ig, które nie związały się przy pierwszym przejściu, co może wystąpić, jeśli ilość załadowanego materiału przekracza pojemność kolumny.
13. Dializować do pożądanego buforu, tj. PBS, pH 7, w temperaturze 4 °C. Objętość buforu dializacyjnego powinna być co najmniej 20 razy większa od objętości roztworu białka. Należy wykonać co najmniej 2 zmiany buforu dializacyjnego, przez co najmniej 2-4 godziny każda, aby zapewnić całkowitą równowagę w buforze dializacyjnym.
14. Jeśli nie będą wykonywane kolejne przebiegi, przepłucz kolumnę PBS zawierającym 0,05 - 0,1% azydku sodu. Zamknąć kolumnę korkiem lub folią Parafilm i przechowywać w temperaturze 4°C.
    
    Uwaga: W razie potrzeby możliwe jest oddzielenie izotypów mysich i ludzkich IgG od białka A za pomocą urządzenia tworzącego gradient (tj.Nr produktu G6897) w celu utworzenia liniowego gradientu pH w 0,1 M buforze cytrynianowym od pH 6,5 do pH 3,0. Całkowita objętość gradientu powinna być co najmniej 10 razy większa od objętości kolumny. Wadą tej metody elucji jest to, że daje ona kilka pików, z których każdy musi zostać zneutralizowany i przetestowany, oraz że daje znacznie bardziej rozcieńczony produkt niż elucja jednoetapowa.

.