Czyszczenie kolumn do chromatografii jonowymiennej i chromatofokusingu

Prawidłowe przygotowanie próbek i buforów oraz zastosowanie płukania o wysokiej zawartości soli (1 M NaCl) na końcu każdej separacji powinno utrzymać większość kolumn w dobrym stanie. Jednak obniżona wydajność, wolne tempo przepływu, rosnące ciśnienie wsteczne lub całkowite zablokowanie wskazują, że medium należy oczyścić przy użyciu bardziej rygorystycznych procedur w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Zaleca się odwrócenie kierunku przepływu podczas czyszczenia kolumny, aby zanieczyszczenia nie musiały przechodzić przez całą długość kolumny. Liczba objętości kolumn i czas wymagany dla każdego etapu czyszczenia mogą się różnić w zależności od stopnia zanieczyszczenia. Jeśli procedura czyszczenia w celu usunięcia typowych zanieczyszczeń nie przywróci wydajności kolumny, należy wymienić górny filtr (jeśli to możliwe) przed wypróbowaniem alternatywnych metod czyszczenia. Podczas wymiany filtra należy zachować ostrożność, ponieważ może to wpłynąć na wypełnienie kolumny i zakłócić jej działanie.

Usuwanie typowych zanieczyszczeń

Następująca procedura powinna być zadowalająca w celu usunięcia typowych zanieczyszczeń:

1. Przepłukać kolumnę co najmniej 2 objętościami 2 M NaCl (Tabela 21 dla zalecanego przepływu).
2. Płukanie przy użyciu co najmniej 4 objętości kolumny 1 M NaOH (taki sam przepływ jak w kroku 1).
3. Płukanie przy użyciu co najmniej 2 objętości kolumny 2 M NaCl (taki sam przepływ jak w kroku 1).
4. Płukać co najmniej 2 objętościami wody destylowanej w kolumnie (taki sam przepływ jak w kroku 1), aż pH linii bazowej UV i eluentu będą stabilne.
5. Płukać co najmniej 4 objętościami buforu startowego lub buforu do przechowywania w kolumnie (taki sam przepływ jak w kroku 1), aż wartości pH i przewodności osiągną wymagane wartości.

Usuwanie wytrąconych białek, lipidów, białek związanych hydrofobowo lub lipoprotein

W celu usunięcia wytrąconych białek:

1. Wstrzyknąć 1 objętość kolumny pepsyny (1 mg/ml w 0,5 M NaCl, 0,1 M kwasie octowym). Pozostawić na noc w temperaturze pokojowej lub na jedną godzinę w temperaturze 37°C.
2. Płukać co najmniej 2 objętościami wody destylowanej (Tabela 21 dla zalecanego przepływu), aż linia bazowa UV i pH eluentu będą stabilne.
3. Płukanie co najmniej 4 objętościami buforu startowego lub buforu do przechowywania, z takim samym przepływem jak w kroku 2, aż pH eluentu i przewodność osiągną wymagane wartości.

Alternatywnie,

1. Płukać 2 objętościami 6 M chlorowodorku guanidyny (Tabela 21 dla zalecanego przepływu).
2. Natychmiast przepłukać co najmniej 5 objętościami buforu o pH 7-8 (Tabela 21 dla zalecanego przepływu).
3. Płukać co najmniej 2 objętościami wody destylowanej (taki sam przepływ jak w kroku 2), aż linia bazowa UV i pH eluentu będą stabilne.
4. Płukać co najmniej 4 objętościami buforu startowego lub buforu do przechowywania (taki sam przepływ jak w kroku 2), aż wartości pH i przewodności osiągną wymagane wartości.

Tabela 21 Zalecany przepływ w zależności od medium, wymiarów kolumny i eluentu.

Kolumna (objętość) lub medium	Woda, bufor, 2 M NaCl lub 1 M NaOH+	6 M chlorowodorek guanidyny	70% etanol lub 30% izopropanol
Kulki MiniBeads (0.24 mL)	0,2 mL/min	0.1 mL/min	0.1 mL/min
MiniBeads (0.8 mL)	0.2 mL/min	0.1 mL/min	0.1 mL/min
MonoBeads (1,7 mL)	0,2 mL/min	0,1 mL/min	0.1 mL/min
MonoBeads (1 mL)	0,5 mL/min	0,25 mL/min	0.25 mL/min
MonoBeads (8 mL)	2 mL/min	1 mL/min	1 mL/min
MonoBeads (20 mL)	5 mL/min	2.5 mL/min	2,5 mL/min
SOURCE 15 4,6/100 PE	0,2 mL/min	0.1 mL/min	0,1 mL/min
RESOURCE 1 mL	1 mL/min	0,5 mL/min	0.5 mL/min
ZASILANIE 6 mL	6 mL/min	3 mL/min	3 mL/min
SOURCE w większych kolumnach**	40 cm/h	20 cm/h	20 cm/h
HiTrap (1 mL)	1 mL/min	0.5 mL/min	0.5 mL/min
HiTrap (5 mL)	5 mL/min	2.5 mL/min	2.5 mL/min
HiPrep (20 mL)	5 mL/min	2.5 mL/min	2,5 mL/min
HiLoad (20 mL)	3 mL/min	2.5 mL/min	2.5 mL/min
HiLoad (53 mL)	8 mL/min	5 mL/min	5 mL/min
Sepharose High Performance w większych kolumnachwiększych kolumnach**	40 cm/h	20 cm/h	20 cm/h
Sepharose Fast Flow w większych kolumnach**	40 cm/h	20 cm/h	40 cm/h
Sepharose XL w większych kolumnach**	40 cm/h	20 cm/h	40 cm/h
Sepharose Big Beads**	40 cm/h	40 cm/h	40 cm/h

* Jeśli uważa się, że zanieczyszczenie jest znaczące, należy użyć niższego natężenia przepływu, aby wydłużyć czas kontaktu przy użyciu 1 M NaOH.
** Podczas czyszczenia większych kolumn należy zapewnić czas kontaktu 1-2 godzin dla każdego roztworu, który jest używany jako wstępny etap czyszczenia.

W celu usunięcia lipidów, hydrofobowo związanych białek lub lipoprotein

W celu całkowitego usunięcia zanieczyszczeń tego typu może być konieczne użycie rozpuszczalników organicznych lub detergentów.

Przed użyciem rozpuszczalników organicznych należy przepłukać medium co najmniej 4 objętościami wody destylowanej, aby uniknąć wytrącania się soli na kolumnie.

Podczas stosowania rozpuszczalników organicznych lub roztworów może być konieczne zmniejszenie natężenia przepływu, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia w kolumnie.

Używaj roztworów czyszczących, takich jak do 100% izopropanol, do 100% metanol, do 100% acetonitryl, do 2 M NaOH, do 75% kwas octowy, do 100% etanol, detergenty jonowe lub niejonowe.

Zawsze sprawdzaj kompatybilność rozpuszczalnika w instrukcji dostarczonej z medium lub kolumną.

Unikaj anionowych detergentów z naładowanymi grupami Q, DEAE i ANX. Unikać detergentów kationowych z grupami naładowanymi S, SP i CM.

Przykłady procedur czyszczenia:

1. Płukać 4 objętościami kolumny do 70% etanolu lub 30% izopropanolu (patrz Tabela 21 dla zalecanego przepływu).
2. Płukać co najmniej 2 objętościami wody destylowanej w kolumnie (patrz Tabela 21 dla zalecanego przepływu), aż linia bazowa UV i pH eluentu będą stabilne.
3. Natychmiast przemyć 3 objętościami buforu startowego w kolumnie (taki sam przepływ jak w kroku 2).

Alternatywnie,

1. Płukać 2 objętościami detergentu w roztworze zasadowym lub kwaśnym, np. 0,1-0,5% niejonowego detergentu w 0.1 M kwasie octowym (patrz Tabela 21 dla zalecanego przepływu).
2. Płukać 5 objętościami kolumny 70% etanolu w celu usunięcia pozostałości detergentu (patrz Tabela 21 dla zalecanego przepływu).
3. Płukać co najmniej 2 objętościami wody destylowanej w kolumnie (taki sam przepływ jak w kroku 1), aż linia bazowa UV i pH eluentu będą stabilne.
4. Płukać 3 objętościami buforu startowego w kolumnie (taki sam przepływ jak w kroku 1).