3D細胞培養ツールおよび技術

• 2D細胞培養 vs. 3D細胞培養
  
• 3D細胞培養の利点
• 3D細胞培養技術の概要
• スキャフォールド（足場）型技術
• スキャフォールドフリー型技術
• おわりに

2D細胞培養 vs. 3D細胞培養

発生生物学、創薬、再生医学、タンパク質生産などといった分野において、細胞培養技術は広く定着しています。細胞培養技術の導入当初より、細胞は組織培養用プラスチック容器、あるいは細胞外基質（ECM）に接着した状態で2次元的に（平面上で）培養されてきました。生理学的環境下においては、細胞は常にECMと相互作用をしています。ECMは細胞遊走やアポトーシス、転写の制御、受容体の発現といった複雑な生物学的機能をコントロールしています¹。2次元環境（2D）で培養した細胞を用いたin vitroでの実験結果を、そのまま臨床試験に反映することは不可能です²。これは、細胞とECMの間の複雑なシグナルのやりとりが2D細胞培養では再現できないことが要因となります³。3次元的（3D）に培養された細胞はこの問題を解消するものであり、in vivoの生理学的環境により近く、従来よりも優れたモデルとして登場しました。表1は2D細胞培養および3D細胞培養の違いをまとめたものです。

表1 2Dおよび3D細胞培養環境下での細胞動態の比較

主な特徴	2D細胞培養	3D細胞培養	参考文献
細胞の形状	平坦で引き伸ばされている	細胞の自然な形状が保たれている（楕円形、または細胞極性がある）	257683383
細胞と培地の間の接触	すべての細胞が培地成分に均一にさらされている	生理学的環境下と同様に、細胞の周囲に存在する培地成分の濃度に勾配がある。深層部よりも表層部の細胞のほうがより多くの培地成分にさらされる（不均一曝露）	159758244, 235011055
細胞間結合	細胞間結合がみられる割合が低く、生理学的環境と異なる	細胞間結合が広くみられ、細胞間のコミュニケーションが可能	226622786
細胞分化	細胞はあまり分化していない	良好に分化する	230223967
薬物代謝	薬物代謝はあまりみられない	CYP酵素の発現量の増加に伴い、薬物代謝が促進されている	237285278, 167716489
薬剤への感受性	細胞の薬剤感受性は高く、薬剤は高い効果を示す	細胞はしばしば耐性を示し、薬剤の効果は弱い	1771142310
細胞増殖	自然環境下と比較して細胞増殖率が高くなる	細胞の種類や3D培養方法の違いによって、細胞増殖率が上下しうる	920151111, 1557619212
刺激への応答性	機械的刺激に対する細胞応答が乏しい	機械的刺激に対して明確な細胞応答が得られる	2688769813
生存能力	サイトトキシンへの感受性が高い	より生存能力が高く、外的要因への感受性が低い	1771142310
アポトーシス	薬剤誘導性アポトーシスへの感受性が高い	薬剤誘導性アポトーシス刺激への耐性が強化される	1902072914

さらに、いくつかの研究から、3D環境下で培養された細胞の遺伝子やタンパク質の発現プロファイルは、2D培養の場合とは異なるという報告がなされています。また、3D培養環境下での発現プロファイルは、2D培養環境の場合と比較して、生理学的に類似していると考えられています。

3D細胞培養の利点

3D培養の場合に示される細胞内外の事象は、生理学的環境下での動態に類似しており、2D培養の場合と比較して以下のような利点が認められます。

• 3D環境で培養された幹細胞は、著しく高い分化能を示す¹⁵
• 3D培養の場合、薬物の安全性試験や効能試験を効率的かつ比較的容易に実施することができるため、製薬会社が創薬に要する期間を短縮することができる¹⁶。また、3D細胞モデルでは薬剤誘導性の肝毒性を効率的に調べることができる¹⁶。
• 3D培養では、薬剤耐性の予測に関してより良好なデータを得られる。In vivoの腫瘍と類似する3D培養細胞群ではアルキル化剤耐性が示されている¹⁷。
• 3D培養モデルを用いることで、ウイルスの増殖や感染、そして病原性ウイルスと宿主の間の相互作用といったウイルス感染症の研究を、より低いバイオセーフティーレベルで実施することができる¹⁸。

3D細胞培養技術の概要

3D細胞培養技術は、細胞自体の特性（細胞株、初代細胞、由来組織）あるいは研究の最終目的といった複数のパラメータに従って選択する必要があります。最適な3D細胞培養技術を選択するには、これらのパラメータを評価することが必須となります。

3D細胞培養技術は、スキャフォールド型とスキャフォールドフリー型に大別されます。

スキャフォールド（足場）型技術

スキャフォールド型技術では、細胞は支持体の存在下で培養されます。主に以下の二種類の支持体を用いることが可能です。

1. ハイドロゲル支持体：ハイドロゲルとは、満遍なく水で膨潤した高分子化合物の網目構造と定義されています。培養される細胞は、こうしたハイドロゲル中に包埋処理されていることもあれば、単純に表面をコーティングされていることもあります。ハイドロゲルは高分子化合物の特性によって、性質別のいくつかのクラスに分類されます（ECMタンパク質系ハイドロゲル、天然ハイドロゲルおよび合成ハイドロゲル）。
2. 高分子性硬質材料支持体：細胞は、繊維状またはスポンジ状の構造体の存在下で培養されます。培養する細胞は平面上に播種されていないために、より生理学的環境下に近い形状になります。支持体としては、ポリスチレン（透明性があるので画像解析用に適している）だけでなく、生分解性のあるポリカプロラクトンなどの素材も用いることができます。
   
   次の表は、こうしたスキャフォールド型技術に関連する特性をまとめたものです。

表 2 スキャフォールド型3D培養技術の特性の概要

技術と特性	ECM系ハイドロゲル	天然ハイドロゲル	合成ハイドロゲル	高分子性硬質材料
製品名	（ラミニン、コラーゲン、 ECMゲル）	（Hystem®）	（TrueGel3D™、Hydromatrix™）	（3D Biotek Inserts、Cellusponge、ゼラチン製スキャフォールド）
生物学的相関性	+++	+++	+/-	+/-
安定性／再現性	-	++	+++	+++
コンタミネーションのリスク	-	++	+++	+++
モジュール性／カスタム化	-	+	++	-
細胞回収	+/-	+	++	+++
下流解析（画像解析、分子解析）	+	++	++	++
HTS／HCS解析	+/-	+/-	+	-

適正）+++ = 高、++ = 中、+ = 低、- = 不適、+/- = スキャフォールドの構成素材によって異なる

スキャフォールドフリー型技術（スフェロイド形成）

スキャフォールドフリー型技術では、細胞が凝集してスフェロイドと呼ばれる非接着性の細胞凝集塊を形成することが可能です。スフェロイドは、独自のECMを分泌し、独特の栄養動態を示すことで組織のような挙動を示します。スキャフォールドフリー型技術によって培養されたスフェロイドは形状や大きさが一定しており、ハイスループットスクリーニングを行う場合に優れたin vitro細胞モデルとなります。スフェロイドを生成するには、用途に合ったプレートから統合されたシステムまで、様々なプラットフォームを用いることができます。下表に、これらの技術の特性をまとめます。

表3 スキャフォールドフリー型3D培養技術の特性の概要

技術と特性	低接着性マイクロプレート	微小流体力学システム	バイオリアクター
製品名	（Corning®社製スフェロイドプレート）	（CellASIC ONIXグラジエントプレート）	（Corning®社製スピナーフラスコまたはローラーボトル）
長期間培養	++	+++	+++
細胞回収	+++	-	+++
画像解析	+++	+++	-
費用対効果	++	-	-
HCS／HTS解析	+++	-	+

適正）+++ = 高、++ = 中、+ = 低、- = 不適

おわりに

3D細胞培養の進化には、in vitro実験とin vivo実験のギャップを解消できるという可能性が秘められています。細胞をin vitroで扱いながらin vivo環境を反映した結果を得ることが可能です。その結果として、実験動物の使用に関する倫理的な問題を回避できる3D細胞培養技術は研究者の間でますます人気が高まっています。一方で、3D細胞培養を行うために適切なシステムを選択することが肝要です。

今後は、さらに複雑で高度な技術が開発されるでしょう。例えば、3Dプリントの副産物である3Dバイオプリンティングは、生体材料および生存細胞のプリントに役立ちます。皮膚移植に際して、従来手法の特徴であった皮膚片を得るための二次的な損傷作成を回避できるという点から、3Dバイオプリンティングは広範な医療分野で応用することが可能です。3Dバイオプリンティングの主要な要素となるバイオインク、スキャフォールド材料、生体材料などに関しては、いずれも自然科学の領域では既に広く認知されています。これらの要素をうまく使うことにより、生理学的環境を再現するような組織製品を開発することが可能となります¹⁹。こうした技術は未だ初期の開発段階にありますが、将来、創薬や毒性試験において不可欠なツールに進化していくことが大いに期待されます。

参考文献

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