ヒトiPS細胞由来腸オルガノイドを用いた薬物の細胞毒性スクリーニング

Kevin Su, Nick Asbrock, Vi Chu, Ph.D., Stefanie Hoffmann, M.S., Philip Hewitt, Ph.D.

ヒト組織に対する、薬物とその代謝物の影響を調べるスクリーニングは、新薬候補を導入する際に重要な影響を及ぼします。経口投与した薬物の吸収は、創薬の初期段階で新規化合物をスクリーニングするための重要な基準になっています¹。ヒト結腸直腸がん由来の形質転換細胞株であるCaco-2細胞の単層培養は、薬物候補の腸透過性を予測するための標準的な腸バリアモデルとして、広く製薬企業に使用されてきました²。Caco-2細胞は、その便利性や入手しやすさがある一方、単一の均質な表現型を持つため、本来の腸上皮の生理を構成する多様な細胞表現型への系統発生を再現することができず、不確定な実験結果をもたらします。幹細胞および組織由来のオルガノイドは、より複雑な3D組織のような構造を持っています³。ヒト上皮性結腸オルガノイドは、薬物スクリーニングの用途により生理学的に相関すると考えられています⁴。メルクは、アッセイ用に凍結保存されたヒト腸オルガノイドと、多数の薬物化合物の細胞毒性効果をテストするために使用された特殊な無血清培地で構成される、高度に評価されたヒトiPS細胞由来の腸オルガノイド系を開発しました。

オルガノイド薬物スクリーニングプロトコル

1. ヒト腸オルガノイド（SCC300）を含む4つのマトリゲル^®マトリックスドームを取り出します。
2. 製品のデータシートに従って、3dGRO®オルガノイド分離試薬（SCM300）を使用してオルガノイドを分離します。
3. マトリックスiPS細胞由来の腸オルガノイド溶液の10 µL マトリゲル^®マトリックスを96ウェルプレート（白色／透明底）に播種します。
4. マトリックスドームを37℃、5％ CO₂で10分間インキュベートします。
5. 3dGRO®ヒト腸オルガノイド培地（SCM304）、10 µM ROCK阻害剤（SCM075）を各ウェルに100 µL加えます。
6. オルガノイドを37℃、5％ CO₂で1日間インキュベートします。
7. 翌日、古い培地を吸引し、新鮮な3dGRO®腸オルガノイド培地（SCM304）、10µM ROCK阻害剤（SCM075）を各ウェルに100µL分注します。
8. オルガノイドを37℃、5％ CO₂ で3日間インキュベートします。
9. 選択した候補化合物を目的の濃度で調製します。
10. 使用済み培地を吸引します。
11. 100 µL／ウェルの処理溶液（化合物+培地）を追加します。
12. 37℃および5％ CO₂で72時間インキュベートします。
13. プレートを30分間室温に放置します。
14. 100 µL／ウェルのCellTiter-Glo^® 3D細胞生存試薬を分注します。
15. プレートをアルミホイルで覆い、室温で5分間振とうします。
16. プレートを室温で25分間インキュベートします。
17. プレートリーダーで発光を測定します。
18. IC₅₀値を計算します。

プロトコルのコツ

• 細胞を播種する前に、マトリックス／オルガノイド溶液を完全に混合して、各ウェルのオルガノイド数ができるだけ同じになるようにします。
• 候補化合物を追加する前に、顕微鏡でオルガノイドの生存率を確認してください。
• 顕微鏡でオルガノイド数を確認し、処理後の細胞数に関するデータを標準化します。

図1. 未処理のヒト腸オルガノイドの形態と成長ヒト腸オルガノイドは、3D マトリゲル（Matrigel^®マトリックスドームで10日間拡大を続け、全体の平均長と面積が増加します。

図2. ヒト腸オルガノイドを使用した薬物の細胞毒性試験CellTiter-Glo^® 3D細胞生存試薬を使用したヒト腸オルガノイドに対する5つの化合物（フラボピリドール、ロペラミド、パラセタモール、ケトプロフェン、およびアロセトロン）の細胞毒性効果。

結論

ここでは、薬物スクリーニング用途向けの従来のCaco-2細胞薬物毒性アッセイの代替細胞モデルとして、ヒトiPS細胞由来の腸オルガノイドの使用をご紹介します。5つの化合物の細胞生存率をテストしたところ、2つの化合物（フラボピリドールとロペラミド）は細胞生存率に悪影響を及ぼし、3つの化合物（パラセタモール、ケトプロフェン、アロセトロン）は細胞生存率に影響を与えませんでした。人間の腸オルガノイドを腸組織モデルとして使用することによって、薬物開発の時間とコストを削減し、薬物吸収と薬物発見に関する新しいインサイトをもたらす可能性があります。

参考文献

1. Aungst BJ. 2017. Optimizing Oral Bioavailability in Drug Discovery: An Overview of Design and Testing Strategies and Formulation Options. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106(4):921-929. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2016.12.002

2. Chandramouli R. 2010. Caco-2 cell lines in drug discovery- an updated perspective. J Basic Clin Pharm.. 1(2):63-9.

3. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, van Es JH, van den Brink S, van Houdt WJ, Pronk A, van Gorp J, Siersema PD, et al. 2011. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141(5):1762-1772. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.07.050

4. Crespo M, Vilar E, Tsai S, Chang K, Amin S, Srinivasan T, Zhang T, Pipalia NH, Chen HJ, Witherspoon M, et al. 2017. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23(7):878-884. https://doi.org/10.1038/nm.4355