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細胞外基質タンパク質と培養細胞の最適化ツール

概要

in vitroの培養条件を最適なものにするため、動物細胞および組織を培養する技術は常に改善されています。細胞外基質（ECM）タンパク質によるコーティング、あるいは細胞培養器具内の化学的または物理的修飾は、よりin vivoでの細胞動態に近づけるために有効であることが示されています。ここでは、注目すべき新たな技術を紹介しながら、現在入手可能な各種のコーティングについて解説します。

背景 1900年代には動物細胞はガラスの表面で培養されていました。しかし、これには入念な洗浄手順が必要であったため、研究者はポリスチレン製の使い捨てプラスチック培養器具が使えるかどうか試し始めました^{1, 2}。しかし、プラスチック培養器具にはいくつかの制約があります³。

血清を含まない培地では細胞の成長と接着が困難
細胞の形、極性や形態の変化
細胞増殖亢進と分化抑制
ホルモンや成長因子への応答性の低下

研究者はその後、培養器具の表面に生物由来物質（生物学的コーティング）と人工合成ポリマー（化学的コーティング）の両方を施すようになりました。これにより、細胞の接着、成長および分化を亢進することができます。コーティング済み面の上での細胞の成長は、平坦で2次元的なプラスチック面の場合と比較して、より自然環境下での成長に近いものとなります。この技術は、生理学的2D環境、あるいは2.5D細胞培養環境と言うことができます。

図1.細胞は、2D培養環境で培養されたときと比べて、細胞外基質タンパク質の存在下ではより生理学的な動態を示します。

生物学的コーティング（ECMタンパク質）や化学的コーティング（ポリリジンなど）の存在下で培養された細胞は、古典的な2D培養環境で培養された細胞と比較して、より生理学的にin vivoの場合と類似した動態を示します。

ECMの構成成分

組織内は、単にみっちりと細胞で敷き詰められているというわけではありません。その空間の大半が細胞間隙となっており、ECMと呼ばれるタンパク質の複雑な網状構造で満たされています。多くの組織において、ECMの構成成分は線維芽細胞から分泌されたものであり、プロテオグリカンや線維状タンパク質（コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラミニン）として分類されます⁴。これらの構成成分は構造を支持することに加えて、細胞間伝達を促進します。細胞表面で細胞骨格をECMと結合させている膜貫通型タンパク質であるインテグリンは、細胞の増殖、形態、接着および細胞死を制御するシグナル伝達経路を活性化します。

コラーゲン

コラーゲンは、哺乳類の体内で最も大量に存在するタンパク質で、総タンパク質量の25%を占めています。3本の（α鎖と呼ばれる）ポリペプチド鎖がらせん構造をとる分子となっており、グリシン残基とプロリン残基を豊富に含みます。コラーゲンは20種類以上ありますが、結合組織中で一般的にみられるのはI型、II型、III型、V型およびXI型コラーゲンです。IX型とXII型は原線維（フィブリル）と関連性をもつコラーゲンであり、原線維同士または原線維とECMを結合します。一方、IV型とVII型はネットワークを形成するコラーゲンであり、基底膜の主たる構成成分となります⁵。

組織内でコラーゲンは構造を支持し、強度と弾力を与えていますが、細胞培養においては細胞の成長、分化および遊走を研究するために用いられます⁶。

入手可能なコラーゲンの種類、使用する細胞株および研究分野

エラスチン

エラスチンは750のアミノ酸からなる疎水性タンパク質で、プロリンとグリシンを豊富に含みます。しかしコラーゲンとは異なり、これらのアミノ酸残基はグリコシル化されていません。例えば、可溶性先駆体タンパク質であるトロポエラスチンは、細胞間隙中に分泌されると集合し、不溶性の弾性線維やシートになります。弾性線維は、組織が必要とする弾力を与え、一時的に伸展された組織が元に収縮することを可能にします⁵。

入手可能なエラスチンの種類、使用する細胞株および研究分野

フィブロネクチン

フィブロネクチンは大型の糖タンパク質（220 kDa）であり、2本のポリペプチド鎖が一端でジスルフィド結合によってつながっています（二量体）。さらに、それぞれのポリペプチド鎖が折りたたまれて、機能的にも構造的にも異なるドメインを形成し、ECMの様々な構成成分（グリコサミノグリカン、プロテオグリカンおよびコラーゲン）や細胞表面タンパク質に結合します。フィブロネクチンは、線維芽細胞、軟骨細胞、シュワン細胞、マクロファージ、腸管上皮細胞、肝細胞などといった様々な結合組織中の細胞から分泌されます⁷。

フィブロネクチンは、細胞の接着や拡散に関わる多機能型のタンパク質です。また、細胞の形態、細胞遊走、細胞骨格の形成、止血、創傷の修復などを制御します。

入手可能なフィブロネクチンの種類、使用する細胞株および研究分野

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ラミニン

ラミニンは基底膜の主たる構成成分となります。ジスルフィド結合によって非対称な十字型構造をとる3本の長いポリペプチド鎖（それぞれα鎖、β鎖およびγ鎖と名付けられています）からなります。ラミニンは、細胞とECMを結合する接着剤の役割を果たします。コラーゲンの結合、細胞接着、ヘパリンの結合および神経突起伸長切断のための活性化ドメインを持っています。また、細胞の成長や運動性、シグナル伝達経路を調節します^3,8。

入手可能なラミニンの種類、使用する細胞株および研究分野

ビトロネクチン

ビトロネクチンは459のアミノ酸からなる糖タンパク質で、ECMや血液中に存在します。75 kDaの1本鎖、または、65 kDaと10 kDaの2本鎖からなる構造をとって血流中を循環します。このビトロネクチンは多糖類（グリコサミノグリカン）やプロテオグリカンと相互作用し、細胞接着分子としての機能を果たします。ビトロネクチンとフィブロネクチンは、相互の機能が類似しており、ともにArg-Gly-Aspという細胞認識配列を持っていますが、構造的にも免疫学的にも異なります⁹。

ビトロネクチンは、細胞傷害性のある補体系を阻害し、凝固系でも生理学的な作用を持っています。さらに、細胞遊走、増殖、分化、内皮細胞や腫瘍細胞の拡散などを促進します。

入手可能なビトロネクチンの種類、使用する細胞株および研究分野

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ECMペプチド

ECM構成成分は、いずれも細胞の機能のための生化学的かつ物理的な目印となっています。現在の技術では、細胞接着のような単純な細胞のプロセスであっても十分な環境を提供できるレベルには達していません。しかしながら、最近の研究により、いくつかのECM由来のペプチドの組み合わせが細胞表面に存在すると、細胞の増殖スピード、細胞接着の強度、そして接着斑の形成が改善されることが示されました¹⁰。Kollodis Bio Sciences社のMAPTrix™技術は、組み合わせ多様なペプチドモチーフを用いることで、インテグリンが仲介するいくつものシグナル伝達プロセスを誘導および／または制御し、真のECM内微小環境をもたらします。Kollodis ECMライブラリーは、多様な細胞表面受容体を制御する手段を与えるものです。本技術では、従来のECMペプチドに代わり、ムール貝由来接着タンパク質に別のペプチドを遺伝的に融合したものを用いることで、無血清培地やフィーダーフリーでも細胞を維持することができます。

化学的・人工合成コーティング

ポリリジンおよびポリオルニチン

人工合成ポリマー（アミノ酸重合体）によるコーティングは、細胞とタンパク質、双方の接着を強化します。ポリリジンやポリオルニチンといったアミノ酸重合体は、ポリスチレン上の正電荷を増やし、細胞が接着できる正に帯電した領域を広げます¹¹。また、人工合成ポリマーによるコーティングは接着因子と併用されます。これにより、細胞膜上の負に帯電したイオンと、培地表面の接着因子の正に帯電したイオンとの間の静電相互作用を促進することが可能です。

化学的コーティングに使われる製品、使用する細胞株および研究分野

CytoSoftコーティング

基質の硬さは細胞機能に影響を与えます。CytoSoft^®プレートは、生体適合性のある薄いシリコン層でコーティングされており、生理学的に幅広い硬度を網羅しています。ゲルの表面はタンパク質と安定的な共有結合を形成しており、接着因子（ECM構成成分）を用いたゲル表面のコーティングや、細胞の播種を容易に行えます。以下はCytoSoft^®プレートの利点となります。

光学的に透明で自家蛍光が少ない
シリコンゲルは加水分解されない
シリコンゲルは安定で、乾燥や吸水の心配がない
裂けやひび割れに強い
長期間保存しても硬度がほぼ変化しない
細胞の回収にトリプシンやコラゲナーゼが使える
酵素処理後の生化学的分解に強い

おわりに

培地表面をECMタンパク質や人工合成ポリマーでコーティングすることは、細胞の動態に大きな影響を与えます。観察される反応は、細胞の種類と基質として用いられるコーティングに応じて異なります。接着因子と接触している細胞の方が長期間生存するとともに、無血清環境でも成長することができます³。接着因子は成長因子を隔離して貯蔵することで、時間的および空間的に成長因子を制御することが可能であり、成長因子受容体とECM受容体の間でクロストークを促進します。また、接着因子は細胞の力学的性質を定義し、適切な環境下での分化を指示する働きがあります。ECMタンパク質もまた、成長因子シグナル伝達と相乗的に、細胞表面の受容体による細胞内シグナル伝達を誘導します¹²。細胞培養技術が進化していく中で、組織のin-vivo環境をより正確に再現し、細胞間でのECMの機能を解読するためには、さらなる構成成分や組み合わせが必要です。