Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaEkspresja i wyciszanie genówNajczęściej zadawane pytania dotyczące siRNA MISSION®

Najczęściej zadawane pytania dotyczące siRNA MISSION®

Czym jest siRNA?

siRNA (krótkie [lub małe] interferujące RNA) to klasa małych dwuniciowych cząsteczek RNA, które wyciszenie ekspresji genów poprzez indukcję RISC  (kompleks wyciszający indukowany przez RNA) do rozszczepienia mRNA.

Dla typowego 21-merowego dupleksu wynosi ona około 13 300. Rzeczywista masa cząsteczkowa jest podana w standardowym certyfikacie analizy / arkuszu danych technicznych.

Dla krótkotrwałego przechowywania, jednoniciowe oligonukleotydy RNA powinny być przechowywane w buforze TE w temperaturze -80 °C. W przypadku przechowywania długoterminowego najlepszą opcją jest przechowywanie w temperaturze -80 °C w postaci osadu etanolu. Podjęcie środków ostrożności w celu zminimalizowania ekspozycji na RNazy wydłuży okres trwałości.

Jeśli zamrażarka -80 °C jest niedostępna, przechowywanie w temperaturze -20 °C prawdopodobnie wystarczy. W przypadku ponownego zawieszenia, przechowywać jako podwielokrotności robocze. Nie zaleca się wielokrotnego zamrażania i rozmrażania lub przechowywania w zamrażarkach "bezszronowych".

Nasz zespół badawczo-rozwojowy przeprowadził przyspieszone badanie stabilności na kilku dupleksach siRNA. Suche dupleksy siRNA przechowywane w temperaturze -20 °C przez trzy lata były stabilne. Suche dupleksy siRNA przechowywane w temperaturze pokojowej wykazywały oznaki niewielkiej degradacji dopiero po dwóch latach. Nasze badanie wykazało pewne różnice w stabilności specyficzne dla sekwencji - tylko niektóre sekwencje wykazywały jakiekolwiek oznaki degradacji po dwóch latach. Jest to reprezentatywne tylko dla dupleksów siRNA.

Nie zaleca się wielokrotnego zamrażania i rozmrażania lub przechowywania w zamrażarkach "bezszronowych". siRNA można przechowywać przez okres do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C. W zamrażarce bezszronowej zalecamy, aby roztwór nie był zamrażany ani rozmrażany więcej niż 3-5 razy. W postaci liofilizowanej dupleksy są stabilne znacznie dłużej w temperaturze -20 °C.

W większości przypadków, Desalt będzie więcej niż wystarczający do zaspokojenia potrzeb. Dupleksowanie oddzielnych nici samoczynnie selekcjonuje oligonukleotydy o pełnej długości, ponieważ proces ten opiera się na idealnym dopasowaniu między samouzupełniającymi się niciami.

W zależności od miejsca produkcji, sam dupleks może być następnie oddzielnie przeprowadzony na niedenaturującym żelu PAGE w celu sprawdzenia jego ogólnej integralności.

Używamy protokołu Tuschla, który został przez nas zwalidowany. Do annealingu inkubujemy 20 µM jednoniciowego 21-zasadowego RNA w buforze do annealingu (100 mM octan potasu, 30 mM HEPES-KOH przy pH 7,4, 2 mM octan magnezu) przez 1 min w temperaturze 90 °C, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Jeśli potrzebne jest wyższe stężenie siRNA, użyjemy więcej niż 20 µM każdej nici.

Istnieje kilka możliwych przyczyn:

  1. Próbka może nie być jednorodna.
  2. Różnice w oprzyrządowaniu mogą prowadzić do różnic w wartościach pozornych. Zalecamy spektrofotometry UV-Vis z podwójną wiązką.
  3. Próbka może być zbyt stężona. Wartości absorbancji są najdokładniejsze w zakresie 0,15 - 0,6 i w zakresie liniowym krzywej standardowej.
  4. Próbka może być zbyt rozcieńczona. Pomiary z rozcieńczeniami o małych objętościach (1 - 1,5 μL) są bardziej podatne na zmiany.
.

Tak, próbki są wysyłane w stanie suchym i są stabilne w temperaturze pokojowej przez 2-4 tygodnie. Po otrzymaniu zalecamy przechowywanie siRNA w temperaturze -20 °C, ale preferowana jest temperatura -80 °C.

Tak, oferujemy niestandardowe siRNA z kilkoma dostępnymi modyfikacjami 5' lub 3'.

Tak, oferujemy niestandardowe siRNA z kilkoma dostępnymi.

Wspólne wybory obejmują:

  • Amino-modyfikator C6, Amino-modyfikator C7: Modyfikacje te są stosowane do blokowania jednego lub obu końców simpleksów (użycie aminy na końcu 5' nici sensownej ułatwia pożądane ładowanie nici antysensownej do RISC) lub do przyłączenia barwnika estrowego NHS, który może nie być dostępny jako fosforoamidyt (bezpośrednie dodanie do jednego z simpleksów podczas syntezy) lub może nie być kompatybilny z chemią rozszczepiania i deprotekcji RNA.
  •  biotyna: Jest ona zwykle używana do przyłączenia cząsteczki znakowanej streptawidyną lub do oddzielenia siRNA od innych cząsteczek.
  • Modyfikator tiolowy C6 S-S: Podobnie jak aminy, może być stosowany do przyłączania innych cząsteczek poprzez wiązanie dwusiarczkowe.
  • Cyjanina 3, 5, & 5.5:  Służy do wykrywania jednego z simpleksów za pomocą fluorescencji, co pomaga w wizualizacji i / lub określeniu wydajności transfekcji.
  • 6-FAM™: Używany do wykrywania jednego z simpleksów poprzez fluorescencję, co pomaga w wizualizacji i/lub określeniu wydajności transfekcji.
  • Fosforan: Może pomóc w procesie selekcji nici, podobnie jak modyfikacje aminowe.
  • 2'-OMe RNA: Odporny na degradację nukleazy komórkowej i oferuje zwiększoną specyficzność.
  • Phosphorothioate: Odporny na degradację przez nukleazy komórkowe.
  • Cholesterol: Poprawa przenikania przez błonę plazmatyczną.

Nasza strona modyfikacje zawiera dodatkowe szczegóły dotyczące powyższych opcji.

Tak, można zamówić to niestandardowe siRNA.

Nie

Używamy nawisów dTdT. Według *Elbashir et al. 2001, "Zwis tymidynowy został wybrany, ponieważ może zwiększać odporność siRNA na nukleazy w pożywce hodowli komórkowej i wewnątrz transfekowanych komórek."

Na początku badań nad RNAi liderzy w tej dziedzinie wybierali zwisy dTdT, więc do pewnego stopnia jest to wybór historyczny. siRNA są często projektowane z nawisami dTdT, ale zwisy UU lub UG są również powszechne. W kilku artykułach Elbashira i wsp. z 2001 r. przedstawiono zestaw zasad projektowania siRNA w oparciu o ograniczoną liczbę genów i systemów, ale badacze nadal używają zwisów dTdT i UU.

*Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K & Tuschl T (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature, 411, 494-498.

Algorytm Rosetta siRNA Design Algorithm wykorzystuje macierze punktacji specyficzne dla pozycji (PSSM) i wiedzę o najważniejszym regionie zalążkowym siRNA, aby przewidzieć najbardziej skuteczne i specyficzne sekwencje siRNA dla docelowego genu zainteresowania. Dodatkowo, algorytm Rosetta siRNA Design Algorithm został przeszkolony w oparciu o informacje zwrotne z ponad 3 lat eksperymentów wyciszania genów, co zapewnia, że zasady algorytmu in-silico są kierowane i wspierane przez rzeczywiste dowody empiryczne.

Nie, jeśli potrzebujesz stabilnych znokautowanych linii komórkowych, zapoznaj się z naszą linią produktów shRNA.

Wyciszenie genów wynikające z siRNA można ocenić już po 24 godzinach od transfekcji. Efekt najczęściej utrzymuje się od 5 do 7 dni. Jednak czas trwania i poziom wyciszenia zależą od typu komórki i stężenia siRNA. Transfekcje mogą być powtarzane w celu utrzymania wyciszenia.

Zademonstrowano, że dodanie enoksacyny do eksperymentów z siRNA spowodowało wzrost zdolności siRNA do wyciszania docelowego genu. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z tym artykułem:

Shan G, Li Y, Zhang J, Li W, Szulwach KE, Duan R, Faghihi MA, Khalil AM, Lu L, Paroo Z, Chan AW, Shi Z, Liu Q, Wahlestedt C, He C & Jin P (2008). A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nat Biotechnol, 26, 933-940.

Another reference which may be helpful is:

Duxbury MS, Ashley SW & Whang EE. (2005). Interferencja RNA: A mammalian SID-1 homologue enhances siRNA uptake and gene silencing efficacy in human cells. Biochem Biophys Res Commun, 33, 459-63.

.

Tak, niestandardowe lub wstępnie zaprojektowane siRNA można łączyć w popularnym formacie składającym się z 4 dupleksów po 5 nmol każdy połączonych w jednej probówce (20 nmol połączonych) oraz dokładnie tych samych 4 dupleksów również po 5 nmol każdy w oddzielnych probówkach (kolejne 20 nmol pojedynczo). Jednak nasze zaawansowane urządzenia do obsługi cieczy pozwalają na szeroki zakres innych możliwości.

Ponadto inną opcją produktu jest esiRNA, który składa się z siRNA powstałego w wyniku rozszczepienia długiego dsRNA (dwuniciowego RNA) za pomocą E. coli RNazy III. Ponieważ esiRNA to pule siRNA, których celem jest ten sam mRNA, są one wysoce specyficzne.

Tak, dla każdego dupleksu, który zostanie połączony, należy pobrać połowę jego ilości i wykonać następujące czynności:

  1. Zawiesić każdy dupleks w 100 µL wody o czystości biologii molekularnej (W4502). Nie ma potrzeby stosowania buforu, ponieważ jest on już zawarty w suchym materiale siRNA
  2.  Usuń 50 µL z każdego pojedynczego siRNA i przenieś do nowej probówki.
  3. Pozostały roztwór siRNA w każdej probówce może być użyty do dodatkowych badań
.

Zalecamy stężenie 50 - 100 µM.

Nie zalecamy ponownego zawieszania wysuszonych siRNA w 1X TE.

Przed ponownym zawieszeniem siRNA należy krótko odwirować probówki. siRNA jest suszone w obecności buforu (pokazano poniżej). Dlatego siRNA należy ponownie zawiesić w wodzie klasy biologii molekularnej (wolnej od DNazy i RNazy) (W4502).

siRNA Buffer:

  •  Octan potasu (100 mM)
  • HEPES (30 mM)
  • Octan magnezu (2 mM)

Uwaga: siRNA są podatne na degradację przez nukleazy wprowadzone podczas obsługi. Należy używać odczynników, probówek i filtrowanych/barierowych końcówek do pipet. Podczas pracy z siRNA należy zawsze nosić rękawiczki.

Odnieś się do tego artykułu.

.

Użyj następującego wzoru:

nmol to ug formula

siRNA to dsRNA:

  • 1 A260 unit = 60 µg dsRNA

.Dlatego

  •  1 OD siRNA = 5 nmol = 60 µg

Zobacz poniższą tabelę (Uwaga: końcowe stężenie siRNA = 30nM; 1 nmol = 1000 pmol):

Zalecamy testowanie siRNA w małych eksperymentach pilotażowych, aby zweryfikować najlepsze stężenie dla każdego typu komórek i nowej procedury eksperymentalnej, stosując zakres stężeń od 5 do 100 nM w pożywce hodowlanej. Stwierdziliśmy, że 30 nM jest zazwyczaj rozsądnym stężeniem początkowym. Należy stosować najniższe stężenie, które skutkuje pożądanym efektem knockdown. Pomoże to zmniejszyć potencjalne efekty poza celem.

Wykazano, że geny z nadekspresją można skutecznie wyciszyć za pomocą siRNA. Trudno jest przewidzieć, w jakim stopniu nadekspresja zostanie zredukowana. Konieczne może być zrównoważenie końcowego stężenia siRNA z wszelkimi kwestiami toksyczności / wrodzonej odporności komórkowej, aby uzyskać funkcjonalne wyciszenie.

Nawet stabilne geny, takie jak powszechne geny referencyjne GAPDH i cyklofilina B, są skutecznie wyciszane przy użyciu typowych metod siRNA. Podczas gdy analiza żywotności komórek jest zawsze dobrą kontrolą, staje się to ważniejsze, gdy dąży się do wyciszenia potencjalnie istotnych genów, które mogą być reprezentowane przez te najbardziej stabilnie wyrażane.

Nasze wstępnie zaprojektowane siRNA okazały się skuteczne w wyciszaniu stabilnego mRNA o wysokiej ekspresji. Podczas gdy białko genu może być dość stabilne, stabilność mRNA nie powinna być istotnym czynnikiem przy stosowaniu siRNA. RNAi jest bezpośrednio ukierunkowane na mRNA w celu rozszczepienia i późniejszej degradacji przez nukleazy komórkowe. Zawsze staraj się zoptymalizować prawidłową ilość siRNA do mRNA będącego przedmiotem zainteresowania w celu prawidłowego określenia empirycznego.

Jeśli chcesz połączyć siRNA w pulę, zamiast samodzielnie łączyć poszczególne siRNA, najlepszą metodą byłoby zamówienie siRNA zawartego w puli jako osobników i przetestowanie osobników w eksperymencie. Sprzedajemy pojedyncze siRNA w stężeniach odpowiednich do łączenia i testowania.

Nie oferujemy odczynnika do transfekcji odpowiedniego dla komórek w zawiesinie. Istnieje kilka skutecznych odczynników dostępnych od innych producentów.

Nie ma jednego protokołu transfekcji. Protokół zależy od wybranego odczynnika do transfekcji. Oferujemy dwa odczynniki:

Oba odczynniki do transfekcji mają biuletyn techniczny z protokołami na stronach zamawiania produktów.

Aby zidentyfikować optymalne warunki transfekcji dla linii komórkowej, zalecamy ustawienie macierzy gęstości komórek i stężenia siRNA. Dobrym pomysłem jest użycie sprawdzonego i wysoce skutecznego siRNA do optymalizacji. Należy również przetestować matrycę z surowicą lub bez surowicy, jeśli jest to odpowiednie dla linii komórkowej.

Linie komórkowe są często wybierane jako funkcja pożądanego badania. Na przykład, badania skupiające się na funkcjonowaniu wątroby często wykorzystują HepG2 lub porównywalne linie komórkowe, ponieważ linie te pochodzą z komórek wątroby.

Większość naszych badań została przeprowadzona na liniach komórkowych HeLa i A549, ponieważ te dwie linie komórkowe są powszechnie stosowane w badaniach naukowych.

Dla kontroli pozytywnych oferujemy Pozytywną kontrolę siRNA. W przypadku kontroli negatywnych zalecamy MISSION® siRNA Universal Negative Controls.

Możemy również syntetyzować niestandardowe kontrole pozytywne lub negatywne. Wielu badaczy ma własne zakodowane sekwencje, których wolą używać, a niektórzy używają kontroli lucyferazy lub siRNA eGFP. Można je zamówić tak samo, jak nasze niestandardowe siRNA.

Zaletą lucyferazy (lub innych genów markerowych) jest to, że można ich używać również jako kontroli pozytywnych podczas współtransfekcji z odpowiednim genem markerowym.

Uzyskanie wysokiej jakości danych z eksperymentów RNAi może być trudne z powodu różnicowej ekspresji genów poza celem. Nie ma jasnej odpowiedzi na pytanie, jak rozwiązać ten problem. Oferujemy esiRNA do eksperymentów knockdown. Produkt ten prowadzi do skutecznego knockdownu przy jednoczesnym zmniejszeniu efektów off-target. esiRNA osiąga to dzięki specyficznym projektom i możliwości stosowania niższych stężeń.

Ponieważ siRNA rozpoznaje i wiąże się z 3' UTR w genach, może zachowywać się podobnie do miRNA (mikroRNA), co może skutkować niezamierzonym wyciszeniem poza celem. Średnio jedna trzecia mRNA ssaków jest celem jednego lub więcej miRNA. Dlatego też, jeśli siRNA wejdzie w szlak miRNA, może to wywołać setki efektów wyciszania poza celem.

Tak, nawiązaliśmy współpracę z firmą PerkinElmer (Bioo Scientific™), aby zweryfikować naszą MISSION® jakość siRNA in vivo;za pomocą MaxSuppressor™ In Vivo RNA-LANCEr II in vivo środka dostarczającego. Sprawdź PubMed, aby zidentyfikować podobne badania w celu określenia konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania.

Tak, oferujemy MISSION® in-vivo siRNA wysokiej jakości. Produkt jest dostępny w ilościach iScale (skala pośrednia) (mg i g) do badań na zwierzętach i na większą skalę.

Referencje na stronie docelowej dla MISSION® in-vivo siRNA wysokiej jakości. Ponadto należy zapoznać się z PubMed, aby zidentyfikować podobne badania w celu określenia konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania.

Zależy to od wybranego odczynnika dostarczającego. Protokół można znaleźć w biuletynie technicznym producenta.

Referencje na stronie docelowej dla MISSION® in-vivo siRNA wysokiej jakości. Ponadto należy zapoznać się z PubMed, aby zidentyfikować podobne badania w celu określenia konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania.

Należy nakreślić konfigurację eksperymentalną dla badań in vivo . Obejmuje to wybór organizmu modelowego, drogi podania, czy użyć odczynnika podającego, dawki i częstotliwości podawania. Dostarczane stężenie będzie w dużej mierze zależeć od charakteru celu, wzorca ekspresji i wielkości badania.

Referencje na stronie docelowej dla MISSION® in-vivo siRNA wysokiej jakości. Ponadto należy zapoznać się z PubMed, aby zidentyfikować podobne badania w celu określenia konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania.

Referencje na stronie docelowej dla MISSION® in-vivo siRNA wysokiej jakości. Ponadto należy zapoznać się z PubMed, aby zidentyfikować podobne badania w celu określenia konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania. Odniesienia na stronie docelowej dla MISSION® in-vivo-quality siRNA. Ponadto należy skonsultować się z PubMed, aby zidentyfikować podobne badania w celu określenia konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania.

Referencje na stronie docelowej dla MISSION® in-vivo siRNA wysokiej jakości. Ponadto należy zapoznać się z PubMed, aby zidentyfikować podobne badania w celu określenia konkretnych potrzeb w zakresie dostarczania.

Walidacja składa się z dwóch części:

  • Wszystkie wstępnie zaprojektowane siRNA są walidowane in silico przy użyciu algorytmu Rosetta.
  • Podzbiór wstępnie zaprojektowanych siRNA zwalidowano funkcjonalnie zgodnie z opisem.
       
    • Odczynniki do transfekcji: Różne odczynniki do transfekcji zostały użyte do funkcjonalnej walidacji konstruktów siRNA.
    • Stężenia siRNA: Zastosowano różne stężenia. Najczęstszym było 50 nM i było ono używane w 60% prac walidacyjnych. Stężenie 50 nM zostało użyte głównie dlatego, że było to stężenie użyte do walidacji algorytmu Rosetta. Następnie potwierdziliśmy wydajność przy znacznie niższych stężeniach.
    • Linie komórkowe: Prawie wszystkie testy walidacyjne zostały przeprowadzone na komórkach HeLa.
    • Formaty: 96-dołkowe płytki.
    • Replikacja: Przeprowadziliśmy co najmniej trzy powtórzenia biologiczne i trzy powtórzenia techniczne dla każdego zwalidowanego siRNA. Dodatkowo, przeprowadzono testy żywotności dla prawie wszystkich eksperymentów walidacyjnych.
    • Czasy zbioru mRNA: Większość pomiarów uzyskano po 24 godzinach od transfekcji.
    • Wykrywanie knockdownu: Technologia rozgałęzionego DNA lub qPCR.

Gwarantujemy, że dwa z trzech naszych wstępnie zaprojektowanych siRNA na gen docelowy osiągną skuteczność knockdown ≥75%. Niestandardowe siRNA nie są gwarantowane.

Przy rozpoczynaniu nowego eksperymentu zalecamy wybranie trzech najlepszych wstępnie zaprojektowanych siRNA.

Powiązane artykuły
Powiązane kategorie produktów
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?