Dwa różne podejścia do przygotowania próbki w celu przezwyciężenia efektu matrycy w LC/MS próbek surowicy lub osocza

Niniejszy artykuł podkreśla wpływ, jaki efekty matrycy próbki mogą mieć na odpowiedź LC/MS i omawia dwa nowe podejścia do jego zmniejszenia.

Wprowadzenie

Postępy w spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpryskową (ESI-MS) zmieniły sposób identyfikacji i kwantyfikacji małych cząsteczek w płynach biologicznych. Systemy są w stanie rutynowo wykrywać poziomy analitów poniżej femtograma. Chociaż te ulepszenia umożliwiają wykrywanie na niskim poziomie, ESI-MS nie jest pozbawiony ograniczeń, z których głównym jest zjawisko tłumienia jonizacji matrycy. Tłumienie jonizacji matrycy wynika z konkurencji ładunków w źródle ESI między składnikami matrycy próbki a docelowymi analitami i powoduje zmniejszoną, zwiększoną i niereprodukowalną odpowiedź analitu.

Negatywny wpływ matrycy próbki na LC/MS

Szczególnie niepokojący w przypadku metod klinicznych, kryminalistycznych i bioanalitycznych jest wpływ fosfolipidów z matrycy. Fosfolipidy są głównym składnikiem błon komórkowych i są znane z zanieczyszczania źródła MS (rysunek 1). Są one głównym czynnikiem przyczyniającym się do tłumienia jonizacji indukowanej matrycą, ponieważ zwykle współekstrahują z analitami podczas przygotowania próbki, która obejmuje wytrącanie białek za pomocą tradycyjnej ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Dodatkowo, fosfolipidy często eluują w tym samym czasie co anality z kolumny HPLC. Ta wspólna elucja zmniejsza czułość, co skutkuje zwiększonymi granicami oznaczalności oraz zmniejszoną precyzją i dokładnością metody. Fosfolipidy zmniejszają żywotność kolumny HPLC, a ich gromadzenie się na kolumnie stanowi problem, ponieważ eluują one w sposób nieregularny, zmniejszając tym samym odtwarzalność metody. Do płukania kolumny HPLC i systemu potrzebna jest nadmierna elucja gradientowa, co ostatecznie zmniejsza przepustowość próbki. Wpływ fosfolipidów na eksperymenty LC/MS został szczegółowo omówiony w poprzednich artykułach Reportera^1-3.

Rysunek 1. Źródło MS zanieczyszczone pozostałościami fosfolipidów po wstrzyknięciu próbek surowicy lub osocza

Podejścia do redukcji efektu matrycy

W tym artykule omówione zostaną dwie nowe techniki łagodzenia efektów matrycy. Techniki te różnią się podejściem do odróżniania docelowych analitów od matrycy próbki. Pierwsza technika koncentruje się na izolacji matrycy próbki, jednocześnie pozwalając docelowym analitom pozostać w roztworze próbki. Druga technika jest podobna do tradycyjnej SPE, w której docelowe anality są izolowane z matrycy próbki. W obu przypadkach nacisk zostanie położony na redukcję matrycy z próbek osocza krwi lub surowicy, w których fosfolipidy są endogennym składnikiem o podstawowym znaczeniu.

Podejście 1: Ukierunkowana izolacja matrycy
To podejście do redukcji matrycy jest ukierunkowane na określone składniki matrycy próbki. W tym przykładzie do selektywnej izolacji fosfolipidów z surowicy lub osocza stosuje się technologię ukierunkowanego usuwania fosfolipidów (HybridSPE-Fosfolipid). HybridSPE-Phospholipid składa się z hybrydowej cząstki cyrkonowo-krzemionkowej upakowanej na 96-dołkowej płytce lub kasecie SPE. Pozbawione elektronów puste d-orbitale atomów cyrkonu wiążą się z bogatymi w elektrony grupami fosforanowymi fosfolipidów poprzez interakcję kwasowo-zasadową Lewisa. Rezultatem jest wysoce wydajna izolacja fosfolipidów. Białka są również usuwane przez wytrącanie bezpośrednio w płytce lub probówce. Próbki osocza lub surowicy są dodawane do płytki lub probówki HybridSPE-Phospholipid, a następnie rozpuszczalnika do wytrącania w stosunku 3:1. Próbki są mieszane za pomocą mieszadła ciągnionego lub mieszadła vortex w celu pełnego wytrącenia białek próbki.

Rysunek 2 przedstawia tę samą próbkę osocza przetwarzaną przy użyciu standardowego wytrącania białek (u góry) lub usuwania fosfolipidów (u dołu) przy użyciu HybridSPE-Phospholipid. Zwróć uwagę na bezpośrednie nakładanie się fosfolipidów z docelowymi analitami w próbce wytrącania białka i jednoczesny spadek odpowiedzi analitu w porównaniu z próbkami przetwarzanymi za pomocą płytki HybridSPE-Phospholipid. HybridSPE usunął fosfolipidy z próbki, eliminując zakłócenia matrycy, co znacznie zwiększyło odpowiedź analitu.

Rysunek 2. Skuteczność techniki HybridSPE®-fosfolipidowej w podejściu ukierunkowanej izolacji matrycy do usuwania zakłóceń

Warunki
Kolumna: Ascentis^® Express F5, 5 cm × 2,1 mm I.D., 2,7 µm (Nr produktu. 53567-U); faza mobilna:prędkość przepływu: 0.4 mL/min; ciśnienie: 1073 psi (74 bar); temperatura kolumny.35°C; detektor: MS, ESI(+) TOF, m/z =100-1000; wtrysk: 2 µL; próbka: każdy związek, 200 ng/mL; system: Agilent 1200SL Rapid Resolution™; 6210 Time of Flight (TOF) MS

Rysunek 3 pokazuje, że próbka przetworzona przy użyciu wytrącania białka spowodowała 75% redukcję odpowiedzi dla propranololu z powodu interferencji matrycy fosfolipidowej. W tych warunkach propranolol eluował w tym samym regionie, w którym eluowała duża część fosfolipidów. Pasek błędu dla propranololu jest znacznie większy ze względu na niereprodukowalne tłumienie fosfolipidów. I odwrotnie, próbki przetworzone przy użyciu HybridSPE-Phospholipid wykazały lepszą odpowiedź dla propranololu wraz ze znacznie mniejszymi słupkami błędów. Dzięki selektywnej izolacji fosfolipidów, do kolumny analitycznej nie wprowadzono matrycy, co skutkuje bardziej dokładną i precyzyjną metodą.

Rysunek 3. Porównanie odpowiedzi analitu (MS) przy użyciu standardowych płytek do wytrącania białek i usuwania fosfolipidów

(Warunki analizy takie same jak na Rysunku 2.)

Podejście 2: Ukierunkowana izolacja analitów
Drugim podejściem do zmniejszenia zakłóceń matrycy jest ukierunkowanie izolacji analitów przy jednoczesnym wykluczeniu składników matrycy próbki. Podejście to jest powszechne w tradycyjnej SPE, gdzie stosuje się procedury wiązania analitu i płukania matrycy. Kontynuacja strategii wiązania analitów jest stosowana w mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME) przy użyciu biokompatybilnych chemikaliów fazowych⁴. Rysunek 4 przedstawia dwie konfiguracje biokompatybilnych włókien SPME (bioSPME) dostępnych obecnie w Supelco.

SPME opiera się na równowagowym rozkładzie analitów między roztworem (w tym przypadku surowicą lub osoczem) a warstwą fazową na włóknie. Włókna BioSPME składają się z cząstek krzemionki modyfikowanej C18 osadzonych w biokompatybilnym spoiwie. Anality są desorbowane z włókna przy użyciu tradycyjnych rozpuszczalników HPLC z fazą odwróconą i analizowane bezpośrednio za pomocą LC/MS. Interesującą właściwością włókna bioSPME jest to, że spoiwo cząsteczkowe chroni większe biomolekuły przed przyleganiem do włókna. Pozwala to na koncentrację docelowych analitów na włóknie bez współekstrakcji matrycy próbki. Rezultatem jest bardzo unikalny proces, w którym stężenie próbki i jej oczyszczanie są przeprowadzane jednocześnie. Ponieważ bioSPME nie jest destrukcyjne, można wykonać wiele ekstrakcji tej samej próbki.

Rysunek 4. Konfiguracje końcówki i sondy biokompatybilne z SPME

Rysunek 5 przedstawia próbkę osocza wzbogaconą dziewięcioma związkami katynonu. Na chromatogramie u góry przygotowanie próbki polegało na standardowym wytrąceniu białka. Dla porównania, chromatogram na dole przedstawia tę samą próbkę wyekstrahowaną za pomocą włókna bioSPME. Zwróć uwagę na różnicę w odpowiedzi sygnału dla obu analitów i fosfolipidów między dwiema technikami: Metoda bioSPME dała ponad dwukrotnie większą odpowiedź analitu, ale jedną dziesiątą odpowiedzi fosfolipidów w metodzie wytrącania białek. Dowodzi to zdolności włókna bioSPME do koncentracji analitów z próbek biologicznych bez zakłóceń ze strony składników matrycy.

Rysunek 5. Skuteczność biokompatybilnej techniki SPME w ukierunkowanej izolacji analitów i usuwaniu zakłóceń

Warunki
Kolumna: Ascentis Express HILIC, 10 cm × 2,1 mm I.D., 2,7 µm (Nr produktu. 53939-U); faza ruchoma:prędkość przepływu: 0.6 mL/min; ciśnienie: 1842 psi (127 bar); temperatura kolumny.35 °C; detektor: MS, ESI(+) TOF, m/z =100-1000; wtrysk: 1 µL; próbka: każdy związek, 50 ng/mL; system: Agilent 1290 Infinity; 6210 Time of Flight (TOF) MS

Podsumowanie

Redukcja efektu matrycy jest ważnym czynnikiem przy opracowywaniu metody LC/MS dla próbek surowicy lub osocza. W tym krótkim raporcie opisano dwie różne techniki przygotowania próbek w celu zmniejszenia efektu matrycy: ukierunkowane usuwanie fosfolipidów przy użyciu HybridSPE-Phospholipid i wzbogacanie analitów przy użyciu biokompatybilnego SPME. Obie metody zapewniają skuteczne środki w celu zmniejszenia zakłóceń matrycy, które mogą pozbawić metodę czułości, odtwarzalności, precyzji i dokładności.

Informacje prawne

Ascentis i HybridSPE są zastrzeżonymi znakami towarowymi firmy Sigma-Aldrich Co. LLC
Rapid Resolution jest znakiem towarowym firmy Agilent Technologies, Inc.
IKA jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy IKA-Werke GmbH & Co. KG

Referencje

1. Aurand C. 2012. Understanding, Visualizing and Reducing the Impact of Phospholipid-Induced Ion Suppression in LC/MS. . Supelco Reporter. 30.2.10– 12.

2. Aurand C. 2013. Investigating Matrix Interference in Analysis of Antiarrhythmic Cardiac Drugs in Plasma; Supelco Reporter . 31.1.12–15.

3. Aurand C. 2013. Improvement in LC-MS/MS Analysis of Vitamin D Metabolites in Serum by leveraging Column Selectivity and Effective Sample Prep.. Supelco Reporter . 31.1.16–17.

4. Bojko B, Pawliszyn J. 2014. In vivoandex vivoSPME: a low invasive sampling and sample preparation tool in clinical bioanalysis. Bioanalysis. 6(9):1227-1239. https://doi.org/10.4155/bio.14.91