Technologia HybridSPE-fosfolipidów

Jak działa HybridSPE-PL?

Technologia HybridSPE-PL jest prostą i ogólną platformą przygotowania próbek, zaprojektowaną do usuwania endogennych białek i fosfolipidów z biologicznego osocza i surowicy przed analizą LC-MS lub LC-MS-MS. Biologiczne osocze lub surowica są najpierw poddawane wytrącaniu białek, w którym biologiczne osocze/surowica jest dodawane do 96-dołkowej płytki, a następnie zakwaszony acetonitryl (środek strącający). Górna fryta PTFE utrudnia przedwczesny przepływ próbki przed zastosowaniem próżni. Po krótkim etapie mieszania/wirowania w celu ułatwienia wytrącania białek, na 96-dołkową płytkę nakładana jest próżnia. Wersja 96-dołkowa zawiera szereg hydrofobowych filtrów/fryt o niskiej porowatości. Zespół filtra/fryty z upakowanym złożem działa jak filtr wgłębny, ułatwiając jednoczesne usuwanie zarówno fosfolipidów, jak i wytrąconych białek podczas procesu ekstrakcji. Po przejściu próbki z wytrąconym białkiem przez urządzenie HybridSPE-PL, uzyskany eluent jest gotowy do natychmiastowej analizy LC-MS lub LC-MS-MS; zalecaną metodę przedstawiono na rysunku 1.

Rysunek 1. Procedura wytrącania "w dołku" przy użyciu 96-dołkowego formatu HybridSPE-PL

Uwaga: Wersja wkładu HybridSPE-PL o pojemności 1 ml nie zawiera filtrów niezbędnych do usunięcia wytrąconych białek. W rezultacie wytrącanie białek musi być przeprowadzone poza wkładem, po czym następuje etap wirowania lub filtracji przed przetwarzaniem HybridSPE. Powstały supernatant/filtrat jest następnie ładowany do wkładu HybridSPE-PL w celu usunięcia fosfolipidów.

Jak usuwane są fosfolipidy?

Po poddaniu próbki osocza/surowicy wytrącaniu białek poprzez dodanie acetonitrylu (zawierającego 1% kwasu mrówkowego), jest ona przepuszczana przez złoże HybridSPE-PL. Wypełnione złoże składa się z opatentowanych cząstek krzemionki pokrytych tlenkiem cyrkonu. Miejsca cyrkonowe wykazują właściwości kwasu Lewisa (akceptor elektronów), które będą silnie oddziaływać z zasadami Lewisa (donor elektronów). Strukturalnie fosfolipidy składają się z polarnej grupy głównej (zwitterionowa grupa fosfonianowa) i dużego hydrofobowego ogona (dwie grupy acylowe tłuszczów, które są hydrofobowe). Grupa fosforanowa nieodłącznie związana ze wszystkimi fosfolipidami działa jako bardzo silna zasada Lewisa, która będzie silnie oddziaływać z atomami cyrkonu funkcjonalizowanymi na powierzchni cząstek (Rysunek 2). Kwas mrówkowy jest krytycznym modyfikatorem stosowanym w czynniku strącającym w celu poprawy odzysku wielu interesujących analitów (np. związków kwasowych). Odgrywa on kluczową rolę w zapobieganiu retencji analitów bez wpływu na retencję/usuwanie fosfolipidów.

Rysunek 2. Schemat HybridSPE-PT 96-dołkowego i mechanizm retencji fosfolipidów

Słowniczek skrótów:

• I.S. - Wzorzec wewnętrzny
  
• LLE - Ekstrakcja ciecz-ciecz
  
• LLOQ - Dolna granica oznaczalności
  
• PPT - strącanie
  
• SPE - ekstrakcja do fazy stałej

TRADEMARKS:

Ascentis, CHIROBIOTIC, HybridSPE - Sigma-Aldrich Biotechnology LP; Fused-Core - Advanced Materials Technologies, Inc.