Analiza narkotyków w moczu

M. James Ross, Olga Shimelis, Hugh Cramer, Teresa Marsala

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 13

Wprowadzenie

Supel^™ Swift HLB SPE to nowy, zastrzeżony i zgłoszony do opatentowania kopolimer posiadający zarówno hydrofilowe, jak i lipofilowe grupy funkcyjne. Jest on przeznaczony do stosowania jako sorbent w ekstrakcji do fazy stałej (SPE) przed analizą instrumentalną, taką jak LC-MS/MS. Podwójna polarność Supel^™ Swift HLB sprawia, że jest on idealny do ekstrakcji szerokiej gamy związków z matryc wodnych i jest odpowiedni do próbek w przemyśle spożywczym iamp; aplikacje środowiskowe, a także próbki biologiczne, takie jak mocz, surowica i osocze. Zrównoważona hydrofilowa i lipofilowa (HLB) właściwość materiału polimerowego umożliwia zatrzymywanie szerokiego spektrum związków o szerokim zakresie polaryzacji i wartości log P (-0,9 - do 4,7). 

W niniejszym badaniu zademonstrowaliśmy oczyszczanie próbek moczu za pomocą ekstrakcji na fazie stałej HLB do analizy opioidów za pomocą LC-MS/MS. Zastosowany 96-dołkowy format SPE (Rysunek 1) jest optymalny dla laboratoriów klinicznych i innych pracujących w środowisku o wysokiej przepustowości.

Rysunek 1. Płytka 96-dołkowa Supel^™ Swift HLB, 30 mg sorbentu HLB/dołek.

Podczas analizy leków nadużywanych w moczu, lek i jego metabolity (np. morfina) mogą występować w postaci glukuronidów (Rysunek 2). W takich przypadkach hydroliza przy użyciu enzymu β-glukuronidazy jest przeprowadzana przed analizą LC-MS próbek, aby zapewnić, że wolna forma leku może być analizowana w badanych próbkach. Następnie próbki wymagają oczyszczenia przed wstrzyknięciem do urządzenia LC-MS. Ekstrakcja do fazy stałej pozostaje najwygodniejszą metodą do stosowania w takim oczyszczaniu próbek.

Rysunek 2. Hydroliza β-glukuronidazy morfino-3-β-D-glukuronidu do morfiny.

Metody

Odzyskiwanie analitów

Syntetyczny mocz, SigMatrix Urine Diluent, został wzbogacony roztworem "Pain Management Multi-Component Opiate Mixture-13" rozcieńczonym do 100 ng/ml dla 12 z 13 związków i 10 ng/ml dla fentanylu. Lista składników i monitorowanych przejść jest dostępna w Tabeli 1. Następujące wzorce wewnętrzne zostały dodane w stężeniu 10 ng/ml: oksykodon-D₃, (±)-metadon-D₉, oksymorfon-D₃, hydrokodon-D₃, cis-tramadol-¹³C, D₃, meperydyna-D₄. Przejścia MS monitorowane za pomocą tych wzorców wewnętrznych przedstawiono w Tabeli 2.

Roztwór β-glukuronidazy o stężeniu 10 kU/g przygotowano w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 6). Roztwór próbki zbiorczej składał się z 3:1:1 SigMatrix rozcieńczalnik do moczu:β-glukuronidaza (10 kU, pH 6,0):bufor fosforanowy (pH 6,0). Próbki poddawano trawieniu przez 2 godziny w temperaturze 60°C z mieszaniem przy 200 obr. Zastosowane warunki hydrolizy zostały wcześniej uznane za optymalne do stosowania enzymu β-glukuronidazy z limfet. Próbki schłodzono, a roztwory próbek dostosowano do pH 9 za pomocą roztworu wodorotlenku amonu. Próbki były następnie przetwarzane na 96-dołkowej płytce Supel^™ Swift HLB zawierającej 30 mg/dołek sorbentu HLB, jak opisano na Rysunku 3. Po przetworzeniu próbki, 75 µL oczyszczonej próbki rozcieńczono 175 µL wody klasy LC/MS, aby zmniejszyć końcowy składnik organiczny do 30%. Próbki analizowano na urządzeniu Sciex 3200 QTrap MS z Agilent 1290 LC (parametry separacji przedstawiono w Tabeli 3). Anality były oznaczane ilościowo za pomocą 5-punktowej zewnętrznej krzywej kalibracyjnej przy użyciu wzorców przygotowywanych codziennie z roztworów podstawowych metanolu przechowywanych w szklanych fiolkach. Wstrzykiwane roztwory kalibracyjne zawierały 10 ng/ml wcześniej opisanych wzorców wewnętrznych w stosunku 70:30 metanol:woda.

Tabela 1. Anality w roztworze "Pain Management Multi-Component Opiate Mixture-13" z ich parametrami wykrywania MS-MS

Związek	log P	pKa	Czas retencji (min)	Q1	Q3	DP (V)	CE (V)	EP (V)	CXP (V)	Wewnętrzny standard
Morfina	0.9	8.2	1.59	286.1	128.1	63	71	8	4	Oxymorphone-D3
Oxymorphone	0.8	8.2	1.73	302.1	284.2	46	23	5.5	4	Oxymorphone-D3
Hydromorphone	1.1	8.2	1.89	286.1	185.3	61	37	5.5	6	Oxymorphone-D3
Naloxone	1.9	7.9	2.38	328.2	310.2	41	23	9	6	Oxycodone-D3
Kodeina	1.4	8.2	2.70	300.1	114.9	61	61	8	8	Oxycodone-D3
Naltrexone	1.9	8.4, 9.9	2.75	328.2	310.2	41	23	9	6	Oxycodone-D3
Oxycodone	0.7	8.5	2.83	316.3	241.1	61	38	8	3	Oxycodone-D3
Hydrocodone	1.2	8.2	2.84	300.2	199.2	56	35	6.5	6	Hydrokodon-D3
Tramadol	1.3	9.4	3.66	264.2	57.9	31	33	6.5	6	cis-Tramadol-13C, D3
Meperydyna	2.7	8.6	3.98	248.2	220.3	51	29	9	4	Meperydyna-D4
Fentanyl	4.1	9.0	4.60	337.2	188.3	46	29	9	4	Meperydyna-D4
Buprenorfina	5.0	8.3	4.67	468.3	55.1	86	85	8	4	Meperidine-D4
Methadone	3.9	9.2	4.95	310.2	265.2	31	19	4	4	Methadone-D9

Tabela 2. Wzorce wewnętrzne stosowane z 13 związkami przeciwbólowymi i ich parametry detekcji MS-MS

Wewnętrzny standard	Czas retencji (min)	Q1	Q3	DP (V)	CE (V)	EP (V)	CXP (V)
Hydrokodon-D3	2.84	303.2	199.2	56	35	6.5	6
Meperydyna-D4	3.98	525.2	224.3	51	29	9	4
(±)-Methadone-D9	4.95	319.2	268.2	31	19	4	4<
Oxycodone-D3	2.83	319.3	244.1	61	38	8	3<
Oxymorphone-D3	1.73	305.1	287.2	46	23	5.5	4
cis-Tramadol-13C, D3	3.66	268.2	57.9	31	33	6.5	6

Rysunek 3. Przygotowanie próbki i metoda SPE.

1 - Ekstrakcja wstępna	5 kU β-glukuronidazy & mieszanina analitów inkubowana przez 2 godziny w temperaturze 60 oC, schłodzona i dostosowana do pH 9<
2 - Kondycjonowanie	1000 µL 5% metanolu w wodzie
3 - Ładowanie	500 µL zhydrolizowanej próbki moczu, pH 9
4 - Płukanie	1000 µL 5% metanolu w wodzie
5 - Elucja	500 µL 100% metanolu z 5% kwasem mrówkowym
6 - Postekstrakcja	Rozcieńczyć 75 µL eluatu 175 µL wody

Tabela 3. Warunki analityczne dla urządzeń Sciex 3200 QTrap i Agilent 1290 LC

Kolumna:	Ascentis® Express Phenyl-Hexyl 10 cm x 2.1 mm I.D., 2,7 µm (53336-U)
Faza ruchoma:	[A] Woda z 0,1% kwasem mrówkowym [B] Acetonitryl z 0.1% kwasem mrówkowym
Gradient:	10% do 45% [B] w ciągu 3 min, 45% do 100% [B] w ciągu 2 min i przytrzymać 2.4 min
Prędkość przepływu:	0.300 mL/min
Detektor:	MS, ESI(+), Scheduled MRM

Wpływ matrycy na jonizację

Próbki zostały przygotowane i przetworzone w sposób opisany wcześniej, z wyjątkiem dodawania analitów i wzorców wewnętrznych. Oczyszczona matryca została wzbogacona po przetworzeniu zarówno analitami, jak i wzorcami wewnętrznymi. Próbki te oznaczono ilościowo za pomocą 5-punktowej zewnętrznej krzywej kalibracyjnej, jak opisano wcześniej.

Wyniki i dyskusja

Procent odzysku

Reprezentatywny chromatogram oczyszczonej próbki SPE z domieszką 100 ng/ml (z wyjątkiem fentanylu w stężeniu 10 ng/ml) przedstawiono na Rysunku 4. Ogólnie rzecz biorąc, 12 z 13 analitów wykazało względny odzysk od 73 do 105% (n=96) z ogólnym odzyskiem 88%, jak pokazano w Tabeli 4 i Rysunku 5. Niższy odzysk dla buprenorfiny przypisuje się log P ~5, co doprowadziłoby do niespecyficznego wiązania.

Dla trzynastu analitów, RSD związane z odzyskiem wynosiły <7,2% (n=96) wykazując spójność na całej płytce. Bez użycia przypisanego wzorca wewnętrznego, bezwzględny odzysk na płytce dla 12 z 13 analitów wynosił 70,5% (pomijając buprenorfinę). Dziewięć z 13 analitów wykazuje odzysk na poziomie ≥70%, jak pokazano na Rysunku 6 w poprzek 96 dołków.

Rysunek 4. Reprezentatywny chromatogram próbek imitujących mocz po oczyszczeniu za pomocą SPE.

Tabela 4. Procentowy odzysk na 96-dołkowej płytce Supel^™ Swift HLB. Anality były dodawane w ilości 100 ng/ml (z wyjątkiem fentanylu 10 ng/ml).

Peak	Compound	Recovery (%)	RSD (%)
1	Morfina	88	5.4
2	Oksymorfon	94	4.1
3	Hydromorphone	94	5.5
4	Nalokson	74	6.9
5	Kodeina	105	7.2
6	Naltrekson	75	6.2
7	Oxycodone	92	6.7
8	Hydrokodon	90	4.6
9	Tramadol	89	2.0
10	Meperydyna	93	3.3
11	Fentanyl	73	6.1
12	Buprenorfina	44	5.8
13	Metadon	90	2.7
	Ogółem*	88	10.8
*Przyjmuje buprenorfinę

Rysunek 5. Względny procent odzysku. Anality zostały wprowadzone w stężeniu 100 ng/ml, z wyjątkiem fentanylu w stężeniu 10 ng/ml. Fioletowe linie kreskowe reprezentują 75 i 120% odzysku, a żółta linia ciągła reprezentuje 100% odzysku. Anality są wymienione w kolejności elucji.

Rysunek 6. Bezwzględny procent odzysku Anality zostały wprowadzone w ilości 100 ng/ml, z wyjątkiem fentanylu w ilości 10 ng/ml. Fioletowe kreski oznaczają 70% bezwzględnego odzysku. Anality są wymienione w kolejności elucji.

Efekty matrycy

Wpływ składników matrycy został obliczony poprzez porównanie odpowiedzi sygnału analitu w metanolu 70:30:woda (co stanowi 100%) z próbką, która została oczyszczona przy użyciu opisanej procedury SPE i została poddana post-spiked (ostatecznie wyekstrahowane próbki zawierały 30% metanolu). W przypadku 13 analitów zaobserwowano minimalny lub zerowy wpływ matrycy (tłumienie lub wzmocnienie) ±10% dla większości analitów, jak pokazano na Rysunku 7. Dwa anality, które zostały najbardziej stłumione to nalokson (-30%) i naltrekson (-20%). Te wartości tłumienia doprowadziłyby do niższego bezwzględnego odzysku zgłoszonego na Rysunku 6 ale zostały skorygowane o względny odzysk poprzez zastosowanie wzorca wewnętrznego (Rysunek 5).

Rysunek 7. Efekty matrycy (tłumienie i wzmocnienie jonów) dla 13 analitów. Fioletowe kreski oznaczają ±10% wpływ na jonizację.

Podsumowanie

Supel^™ Swift HLB SPE jest hydrofilową i lipofilową polimerową fazą SPE przeznaczoną do ekstrakcji szerokiego zakresu związków ze złożonych matryc próbek wodnych. W tym badaniu wykazaliśmy przydatność tej fazy SPE do przygotowania próbek moczu do analizy serii leków przeciwbólowych łatwo dostępnych w postaci gotowej mieszaniny. Nie było wymagane zagęszczanie po ekstrakcji ani suszenie próbek. Względne odzyski analitów mieściły się w zakresie 73-105%, z jednym wyjątkiem buprenorfiny. Odtwarzalność na całej płytce była doskonała i wynosiła ≤7,2% RSD. Minimalny wpływ matrycy (±10%) zaobserwowano po oczyszczeniu SPE Supel^™ Swift HLB. Opracowana metoda SPE może być stosowana do analizy szerszego zakresu analitów w moczu.

Więcej informacji na temat testów klinicznych można znaleźć na stronie SigmaAldrich.com/clinical