Ekstrakcja do fazy stałej: Metodologia odwróconej fazy

Matryca próbki wodnej/środowisko fazy ruchomej

SPE w fazie odwróconej jest uważana za najmniej selektywny mechanizm retencji w porównaniu do SPE w fazie normalnej lub SPE z wymianą jonową. Innymi słowy, metoda odwróconej fazy lub chemia wiązań może być trudna do rozróżnienia między cząsteczkami, które są strukturalnie podobne. Jednakże, ponieważ faza odwrócona zatrzyma większość cząsteczek o dowolnym charakterze hydrofobowym, jest bardzo przydatna do ekstrakcji analitów o bardzo zróżnicowanej strukturze w tej samej próbce.

SPE w odwróconej fazie
Mechanizm retencji:	Oddziaływania niepolarne lub hydrofobowe Siły Van der Waalsa lub dyspersyjne
Matryca próbki:	Próbki wodne Płyny biologiczne (surowica, osocze, mocz) Wodne ekstrakty tkanek Próbki wody środowiskowej Wino, piwo i inne próbki wodne
Charakterystyka analitu:	Anality wykazujące niepolarne właściwości funkcjonalne Większość analitów organicznych Alkilowe, aromatyczne, alicykliczne grupy funkcyjne
Schemat elucji:	Zakłócić interakcję fazy odwróconej z rozpuszczalnikiem lub mieszaninami rozpuszczalników o odpowiednim niepolarnym charakterze Metanol, acetonitryl, dichlorometan Mieszaniny bufor/rozpuszczalnik
Wspólne zastosowania:	Leki i metabolity w płynach biologicznych Zanieczyszczenia środowiskowe w wodzie Wodne ekstrakty tkanek i ciał stałych

Podstawowe kroki

1. Obróbka wstępna próbki W przypadku próbek obciążonych zakłóceniami (np. płyny biologiczne) należy rozcieńczyć próbki w stosunku 1:1 buforem. Manipulacja pH może być ważna w przypadku związków jonizowalnych. Stan jonizacji związku może drastycznie zmienić jego charakterystykę retencji i elucji na danym sorbencie SPE.
   Gdy analit jest w postaci obojętnej, staje się bardziej hydrofobowy, a retencja wzmacnia się w warunkach fazy odwróconej. Dostosowanie pH próbki do 2 jednostek pH powyżej lub poniżej pKa związku (w zależności od grupy funkcyjnej) skutecznie zneutralizuje związek. W przypadku tkanek i innych ciał stałych należy przeprowadzić ekstrakcję ciało stałe-ciecz lub homogenizację przy użyciu buforu. Rozpuszczalniki o charakterze niepolarnym (w tym metanol i izopropanol) zakłócają interakcję między związkiem a grupami funkcyjnymi sorbentu.
   Aby uniknąć zatykania, może być konieczne odwirowanie, rozcieńczenie i/lub wstępne przefiltrowanie próbki przed
   wprowadzeniem jej do fazy SPE.
   
2. Kondycjonowanie/Equilibration Kondycjonowanie zwilża lub aktywuje fazy związane, aby zapewnić spójną interakcję między analitem a grupami funkcyjnymi sorbentu. Sorbenty o odwróconej fazie są często kondycjonowane 1-2 objętościami rozpuszczalnika mieszalnego z wodą, takiego jak metanol lub acetonitryl.
   Wyrównanie wprowadza roztwór podobny do ładunku próbki pod względem siły rozpuszczalnika i pH w celu maksymalizacji retencji. 1-2 objętości buforu (używanego do wstępnej obróbki próbki) lub wody są dobrym wyborem do wyrównania fazy odwróconej.
   
3. Załadunek próbki Nałóż próbkę (z kroku 1) przy stałym i zmniejszonym natężeniu przepływu ~1-2 kropli/sekundę, aby zapewnić optymalną retencję.
   
4. Płukanie  Interferencje próbki są często zatrzymywane razem ze związkami będącymi przedmiotem zainteresowania podczas ładowania próbki. Etap płukania jest niezbędny do elucji zakłóceń bez przedwczesnej elucji związków będących przedmiotem zainteresowania. 5-20% metanolu w wodzie lub buforze do wstępnej obróbki próbki jest typowym rozpuszczalnikiem do przemywania.
   
5. Elucja Zakłóć hydrofobowe interakcje między analitem a grupami funkcyjnymi sorbentu za pomocą rozpuszczalnika organicznego lub kombinacji rozpuszczalników o wystarczającym charakterze niepolarnym. Przykładowe rozpuszczalniki do elucji to 1-2 objętości metanolu lub acetonitrylu.
   Manipulacja pH podczas elucji może często poprawić odzysk w przypadku związków jonizowalnych. W postaci jonowej związki zasadowe i kwaśne stają się bardziej polarne, osłabiając interakcję fazy odwróconej, co może pozwolić na słabsze rozpuszczalniki elucyjne i/lub zmniejszenie objętości elucji.
   
6. Eluate Post-treatment Często konieczne jest odparowanie i odtworzenie eluatu SPE w fazie ruchomej przed analizą LC. Analiza GC często wymaga dalszego zagęszczenia eluatu SPE i/lub ewentualnej wymiany matrycy na bardziej lotny rozpuszczalnik.

Wskazówki dotyczące SPE

1. Wiązanie lek-białko powinno zostać zakłócone podczas wstępnej obróbki próbki.
   Strategie obejmują:
   • 40 µL 2% EDTA disodowego na 100 µL osocza myszy
   • 40 µL 2% kwasu mrówkowego na 100 µL osocza myszy
   • Inne możliwe odczynniki (na 100 µL matrycy):
     40 µL 2% TCA, 40 µL 2% kwasu octowego, 40 µL 2% TFA, 40 µL 2% kwasu fosforowego lub 200 µL MeCN (białko ppt.).
2. Jeśli eluat SPE musi zostać odparowany przed analizą, przepuść powietrze próżniowe przez rurkę SPE przez około 10 minut po elucji. Spowoduje to usunięcie resztkowej wilgoci, która może przedłużyć odparowanie.
   
3. Stałe i wolne natężenie przepływu (1-2 krople na sekundę) podczas ładowania próbki i elucji poprawi odzysk i powtarzalność.
   
4. Zmniejsz masę złoża, aby zminimalizować objętość elucji.
   
5. Zwiększ masę złoża, aby zatrzymać więcej związków polarnych.
   
6. Troska o przesuszenie sorbentu jest krytyczna tylko podczas kondycjonowania metanolem.
   
7. Rozpuszczalnik wstępnie kondycjonujący, taki jak dichlorometan (lub rozpuszczalnik używany do elucji), może być użyty przed kondycjonowaniem w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń z rurki SPE, które mogą zakłócać późniejszą analizę.