Metoda LC/MS/MS oznaczania glifosatu, AMPA i glufosynatu w zbożach
Wprowadzenie
Glifosat jest jednym z najczęściej stosowanych herbicydów na świecie. Jego użycie znacznie wzrosło po wprowadzeniu genetycznie zmodyfikowanych upraw tolerujących glifosat, takich jak kukurydza, soja i bawełna. Obecnie na polach stosuje się ponad 1,4 miliarda funtów glifosatu rocznie.1 Dokument regulacyjny US EPA CFR - tytuł 40 - tom 24 określa poziomy tolerancji dla występowania glifosatu w produktach spożywczych i produktach.2
Poziomy tolerancji EPA dla pozostałości glifosatu w ziarnach zbóż (zwanych również grupą upraw 15) są ustalone na 30 ppm. Nie dotyczy to ryżu, soi i kukurydzy. W przypadku ryżu tolerancja wynosi 0,1 ppm, podczas gdy w przypadku kukurydzy cukrowej jest to 3,5 ppm.2 W przypadku glufosynatu, herbicydu, który jest często uwzględniany z glifosatem w metodach analitycznych, wartości tolerancji wynoszą 0,4 ppm dla ziaren zbóż i 1,0 ppm dla ryżu. Te wartości tolerancji obejmują metabolity i degradanty. Dlatego też metabolit glifosatu (kwas aminometylo)-fosfonowy (AMPA) został również uwzględniony w tym badaniu (Rysunek 1).
Rysunek 1. Struktury glifosatu, AMPA i glufosynatu
Ponieważ glifosat jest szeroko stosowany w produkcji soi i kukurydzy, spodziewano się, że zostanie znaleziony w tych towarach. W tej aplikacji skupiliśmy się na badaniu obecności glifosatu w innych zbożach (owies i pszenica) wykorzystywanych do produkcji płatków śniadaniowych, w tym produktów zbożowych dla niemowląt.
W ciągu ostatnich 30 lat opracowano różne metody analizy glifosatu. Niektóre z nich wymagały derywatyzacji analitów do HPLC z detekcją fluorescencyjną z o-ftaldehydem.3 Metoda derywatyzacji glifosatu przy użyciu chlorku fluorenylometyloksykarbonylu (FMOC) i detekcji fluorescencyjnej została zaproponowana i jest stosowana przez niektóre laboratoria.4 Ostatnio, wraz z pojawieniem się nowoczesnych, bardziej czułych i wytrzymałych instrumentów LC/MS/MS, możliwe stało się analizowanie glifosatu i jego metabolitów bez derywatyzacji. W tej pracy wykorzystaliśmy bezpośrednią analizę glifosatu metodą MS/MS.
Eksperymentalne
W celu potwierdzenia skuteczności metody wykorzystano organiczne błyskawiczne płatki owsiane i organiczną mąkę pełnoziarnistą. Żywność ta została przeskanowana pod kątem obecności glifosatu i nie stwierdzono jego obecności. Mąka pełnoziarnista została użyta bez zmian, a płatki owsiane błyskawiczne zostały zmielone przed użyciem. W celu zbadania wydajności metody, obie matryce zostały wzbogacone w 100 ppb glifosatu i 100 ppb glufosynatu.
Owies został również wzbogacony w 100 ppb AMPA. Ekologiczna mąka kukurydziana została również zakupiona i przetestowana na obecność glifosatu i okazała się wolna od glifosatu. Ta sama metodologia może być również stosowana do testowania mąki kukurydzianej i produktów kukurydzianych.
Do badań przesiewowych, następujące matryce wykorzystały opracowane metody i zostały przetestowane na obecność glifosatu: biała mąka, płatki owsiane błyskawiczne, płatki ryżowe dla niemowląt, płatki owsiane dla niemowląt i mieszane płatki zbożowe dla niemowląt.
Obróbka wstępna
Metoda ekstrakcji opierała się na metodologii QuPPe (Quick Polar Pesticides Method) opracowanej w Unii Europejskiej (UE) dla owoców i warzyw i wykorzystywała wodę:metanol (50:50) zawierający kwas mrówkowy jako końcowy rozpuszczalnik ekstrakcyjny.5 Pięciogramową próbkę homogenizowanego ziarna lub zboża odważono do 50 ml probówki wirówkowej. Dodano wodę (10 ml) i 100 μl roztworu wzorca wewnętrznego (20 μg/ml każdego analitu w wodzie). Następnie próbki pozostawiono na 30 minut do dwóch godzin. Następnie dodano 10 ml metanolu zawierającego 1% v/v kwasu mrówkowego. Próbki mieszano przez 15 minut w wytrząsarce laboratoryjnej i odwirowano. Dwie próbki użyte podczas walidacji, owies i pszenica, dały znacząco różne ekstrakty. Podczas gdy owies dawał klarowny, żółty ekstrakt, ekstrakt pszenicy był mętny i trudny do przefiltrowania. W rezultacie zastosowano dwie różne procedury oczyszczania próbek dla różnych próbek ziarna.
Oczyszczanie próbek za pomocą SPE
W przypadku próbek, które nie zawierały cząstek stałych po ekstrakcji i odwirowaniu, zastosowano ekstrakcję do fazy stałej (SPE) przy użyciu wkładu Supel™- Select HLB, podobnie jak w metodzie opisanej przez Chamkasema i Harmona.6 Wkłady HLB kondycjonowano przy użyciu 100% metanolu, a następnie wody:metanolu (50:50) zawierającego 0,5% v/v kwasu mrówkowego. W przypadku wkładów SPE o pojemności 1 ml do dalszego kondycjonowania wkładu użyto 0,5 ml ekstraktu próbki. Eluat z tego etapu kondycjonowania został odrzucony. Druga porcja ekstraktu próbki (0,5 ml) została załadowana do wkładu HLB. Ten eluat został zebrany i przefiltrowany przez fiolki z filtrem polipropylenowym o grubości 0,2 mikrona.
Oczyszczanie próbek za pomocą ultrafiltracji
Urządzenia do ultrafiltracji zostały użyte do oczyszczania ekstraktów próbek, takich jak pszenica, które zawierały cząstki stałe po etapie wirowania. W niniejszej pracy zastosowano membrany polieterosulfonowe o masie cząsteczkowej 3 kDa (MWCO). Membrany zostały wstępnie kondycjonowane przez przepuszczenie 0,5 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego przez wirowanie przy 4000 obr/min przez 5 minut w celu utrzymania stałego czasu retencji glifosatu. Ten przelotowy rozpuszczalnik został odrzucony i załadowano 1 ml ekstraktu próbki. Etap ultrafiltracji przeprowadzono przez wirowanie przez 45 minut przy 4000 obr. Ustalono również, że urządzenia do ultrafiltracji zawierające membranę z regenerowanej celulozy, takie jak filtry odśrodkowe Amicon™ Ultra o MWCO 3 kDa, mogą być stosowane na tym etapie bez wstępnego przygotowania. Przejrzysta próbka, która przeszła przez membranę została zebrana i poddana analizie. Do analizy użyto fiolek o niskiej absorpcji, aby zapobiec utracie analitów na powierzchni szkła.
Przygotowanie próbek piwa
Próbki piwa można analizować przy użyciu tej samej metodologii. Najpierw przeprowadzono dokładne odgazowanie piwa, umieszczając próbkę piwa w łaźni ultradźwiękowej na 15 minut. Następnie 5 ml próbki piwa zmieszano z 5 ml metanolu z 1% kwasem mrówkowym i wzorcem wewnętrznym. Próbka ta została krótko wymieszana i oczyszczona przy użyciu procedury SPE.
Metoda LC/MS/MS
Kolumna HPLC użyta do tej analizy była oparta na polimerze apHera™ NH2 kolumna, która zapewnia stabilne i solidne separacje LC od pH 2 do 13. Gradient fazy ruchomej wykorzystywał wodę i węglan amonu przy pH 9. Ta faza ruchoma zapewniała właściwą jonizację glifosatu, który ma w swojej strukturze grupę fosforanową, z detekcją w ujemnych warunkach ESI. Ponadto bufor węglanu amonu jest lotny i w pełni kompatybilny z oprzyrządowaniem LC/MS. Tabela 1 zawiera warunki MS dla wszystkich analitów, a Rysunek 2 przedstawia chromatogram standardowego wstrzyknięcia. Analizę przeprowadzono przy użyciu urządzenia AB Sciex QTrap 3200. To ograniczyło czułość metody. Jednak, jak widać poniżej, metoda była w stanie określić ilościowo zanieczyszczenie glifosatem w większości próbek w tym badaniu.
Wyniki
Wydajność metody
Obydwie metody oczyszczania SPE i ultrafiltracji zapewniły dobre oczyszczenie próbki i były akceptowalne dla analizy LC/MS. W płatkach owsianych wszystkie trzy anality zostały wykryte i oznaczone ilościowo na poziomie 100 ppb. W mące pszennej glifosat i glufosynat oznaczono ilościowo na poziomie 100 ppb. Wyniki testów metod przedstawiono w Tabeli 2. Metoda dla próbek pszenicy dała nieco wyższe niepewności, do 19% RSD. W metodzie dla pszenicy nie zastosowano oczyszczania SPE, a uzyskane sygnały miały wyższe tłumienie jonów w porównaniu z próbkami oczyszczonymi za pomocą SPE, takimi jak owies. Ogólnie rzecz biorąc, we wszystkich próbkach występowały różne stopnie tłumienia jonów, od 50% do 80%, dlatego ważne było zastosowanie wzorców wewnętrznych w celu dokładnego oznaczenia ilościowego.
Rysunek 2.Analiza LC/MC glifostatu, AMPA i glufosynatu na apHera NH2
Glifosat w piwie
W badanym piwie nie znaleziono żadnych analitów. W związku z tym próbka piwa została wzbogacona glifosatem i glufosynatem w stężeniu 50 ppb i poddana analizie. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2.
Identyfikacja i oznaczanie ilościowe glifosatu w zbożach
Wyniki oznaczania ilościowego glifosatu w zbożach przedstawiono w Tabeli 3. Próbki błyskawicznych płatków owsianych (Rysunek 3) i białej mąki zawierały znaczne ilości glifosatu, odpowiednio 1,2 i 0,8 ppm. Próbka organicznych płatków owsianych nie zawierała wykrywalnych ilości glifosatu (Rysunek 4). Płatki ryżowe dla niemowląt miały bardzo niski poziom glifosatu. Poziomy były zbliżone do granicy czułości przyrządu, ponieważ matryca i wynikające z niej RSD były wysokie. Zboża owsiane dla niemowląt zawierały glifosat na poziomie 1,1 ppm, a mieszane zboża dla niemowląt zawierały glifosat na poziomie 0,25 ppm. Żadne ze zbóż dla niemowląt nie było oznaczone jako organiczne. Glufosynat nie został znaleziony w żadnych produktach zbożowych. AMPA znaleziono tylko w błyskawicznych płatkach owsianych na niskim poziomie.
Rysunek 3. Glifosat w trybie natychmiastowym
Rysunek 4.Próbka organicznej mąki owsianej, ślepa próba i domieszka 100ppb glifosatu
Wnioski
Proponowana metoda opracowana dla glifosatu i związków pokrewnych wykorzystuje detekcję LC/MS/MS oraz kolumnę apHera NH2 opartą na polimerze jonowymiennym, która jest stabilna w warunkach wyższego pH. Metodologia przygotowania próbek została opracowana w celu ekstrakcji glifosatu ze zbożowych produktów spożywczych. Metodologia ta obejmowała oczyszczanie przy użyciu polimerowej SPE, którą z powodzeniem zastosowano do próbek zbóż, w tym płatków owsianych i produktów zbożowych dla niemowląt. Oczyszczanie obejmujące ultrafiltrację zostało opracowane dla produktów zawierających pszenicę i zostało z powodzeniem zastosowane do próbek mąki pszennej. Zastosowanie izotopowo znakowanych wzorców skutkowało lepszą dokładnością oznaczania glifosatu i pozwoliło na wykorzystanie krzywych kalibracyjnych opartych na rozpuszczalnikach poprzez kompensację efektów jonizacji obecnych w próbkach. Metoda okazała się wytrzymała i działała dobrze, nawet gdy była stosowana na starszym i mniej czułym oprzyrządowaniu.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?