Oznaczanie białka metodą kwasu bursztynowego (BCA)

CEL

Zapewnienie standardowej procedury ilościowego oznaczania całkowitego stężenia białka w roztworze metodą BCA.

ZAKRES

Protokół ten ma zastosowanie do wszystkich produktów regulowanych wymagających analizy białek metodą BCA.

DYSCUSSION

Białka redukują zasadową Cu (II) do Cu (I) w sposób zależny od stężenia. Kwas bikinchoninowy jest wysoce specyficznym odczynnikiem chromagennym dla Cu (I) tworzącym kompleks o maksimum absorbancji przy 562 nm. Ze względu na tę właściwość wynikowa absorbancja przy 562 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia białka. Albumina surowicy bydlęcej jest używana jako wzorzec białka.

DEFINICJE

N/A

ODPOWIEDZIALNOŚĆ

N/A

PROCEDURA

Odczynnik

• Roztwór kwasu bicynchoninowego, Nr produktu. B9643.
• Copper (II) Sulfate Pentahydrate 4% Solution, Product No. C2284.
• Roztwór wzorcowy białka, 1.0 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), Nr produktu  P0914.
• Próbki testowe

UWAGA: Inne BSA mogą być używane jako standard. Jeśli jednak wymagane jest rozcieńczenie do 1 mg/ml, należy potwierdzić stężenie białka za pomocą absorbancji przy 280 nm, stosując E^1%₂₈₀ = 6,67. Próbki powinny zawierać od 0,2 do 10 mg/ml białka, aby pozostać w zakresie liniowym tego testu.

Materiały

• Spektrofotometr, Uvikon 943 lub równoważny.
• Pipeta/końcówki
• Próbówki
• Stojak na probówki
• Kuwety jednorazowe, Nr produktu. C5416 lub równoważny.
• Inkubatory, Imperial III lub równoważne.

Środki ostrożności

W celu uzyskania informacji o zagrożeniach chemicznych i odpowiednich środkach ostrożności należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS).

Metoda

1. Przygotuj odczynnik do oznaczania białek, dodając I mL roztworu  Copper (II) Sulfate Pentahyrate 4% Solution (C2284) do 49 ml roztworu kwasu bicinchoninowego (B9643).

2. Dodaj ilościowo wskazane ilości wody i wzorca białka do wskazanych probówek.

3.

Tubka	ml wody	ml wzorca białka
1	0.5	0
2	0.3	0.2
3	0.2	0.3
4	0.1	0.4
5	0.0	0.5

3. Przygotować probówki reakcyjne w następujący sposób: Próbki należy przygotować w dwóch egzemplarzach.

Tube	mL Protein Standard	mL próbki lub kontroli	mg/mL białka	mL Protein DeterminationReagent
1	1	-	0	2.0
2	0.1	-	0.4	2.0
3	0.1	-	0.6	2.0
4	0.1	-	0.8	2.0
5	0.1	-	1.0	2.0
6	-	0.1	?	2.0
7	-	0.1	?	2.0

4. Worteksować każdą probówkę, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie.

5. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

6. Pozostawić probówki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed pomiarem absorbancji.

7. Wyczyść spektrofotometr względem wody. Zmierzyć absorbancję wzorców (probówki 1-6) przy 562 nm.

8. Użyj znanego stężenia białka wzorców do utworzenia krzywej wzorcowej. Jeśli punkty danych wykazują znaczne odchylenie od linii krzywej standardowej, skonsultuj się z nadzorem wydziału. Nachylenie linii powinno wynosić około 1,0.

9. Odczytać absorbancję próbek przy 562 nm. Użyć krzywej standardowej do obliczenia stężenia białka w mg/ml..

10. Aby uzyskać końcowe stężenie białka, pomnóż przez dowolny współczynnik rozcieńczenia, który był wymagany do uzyskania stężenia w zakresie liniowym testu. Uśrednij wyniki próbki na potrzeby raportowania.

11. Wypełnij odpowiedni arkusz roboczy.