Protokół spinokulacji

Biblioteki MISSION^® TRC shRNA są kolekcjami wektorów shRNA opartych na lentiwirusach do stosowania w badaniach wyciszania genów. Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie MISSION^® TRC shRNA Lentiviral Particles w szczególności do długoterminowego wyciszania i obserwacji fenotypu w komórkach zawiesinowych. Poniższy protokół został opracowany na podstawie literatury¹ do stosowania w 6-dołkowej płytce z MISSION^® cząsteczkami lentiwirusowymi.

System ExpressMag™ (SHM01 lub SHM02) został również zoptymalizowany do transdukcji komórek zawiesinowych w czasie o 24 godziny krótszym niż ten protokół i w wielu formatach hodowli tkankowych.

Przejdź bezpośrednio do

• Materiały
• Protokół
• Notatki

Materials

MISSION^® lentiviral particles

Utilize SHC002V lub SHC001V w celu optymalizacji protokołu transdukcji. Transdukcja SHC003V może być monitorowana za pomocą FACS lub mikroskopii fluorescencyjnej, ale protokoły do tego są poza zakresem tego dokumentu. Bardzo ważne jest, aby najpierw zoptymalizować protokół, aby mieć pewność co do wydajności transdukcji, co pozwoli oddzielić wpływ ładunku lentiwirusowego (shRNA lub niestandardowego ładunku) od wydajności transdukcji. Następnie, po przejściu na MISSION^® lentiwirusa, który wyraża shRNA, wszelkie zmiany w wynikowej liczbie kolonii lub żywotnych komórek można przypisać efektom shRNA i nie można ich przypisać niskiej wydajności transdukcji. Po zoptymalizowaniu wydajności transdukcji, wykorzystaj cząsteczki MISSION^® lentiwirusowe wyrażające shRNA ukierunkowane na interesujący cię gen lub wykorzystaj custom MISSION^® lentiwirusowa cząsteczka wyrażająca dowolny shRNA lub interesujący gen.

Puromycyna  (P9620)
10 mg/ml roztwór podstawowy do selekcji<<

Pełna pożywka
Dla komórek Jurkat DME zawierająca 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą lub pożywkę dla danego typu komórek.

Błękit trypanu (93595)

.12 x 15 mL stożków (CLS430790)

6-dołkowa płytka do hodowli tkanek (CLS3516)

Wirówka wahadłowa
Wirówka powinna być wyposażona w regulację temperatury i wstępnie ogrzana do 32 ºC przed transdukcją komórek.

Hemacytometr (Z359629)
Hemacytometr służy do zliczania komórek.

Protokół

1. Określ końcowe stężenie puromycyny, które ma być użyte w selekcji. Dokładne stężenie jest zależne od linii komórkowej i powinno być określone przez 72-godzinny test cytotoksyczności na nietransdukowanych komórkach.
2. Używaj tylko sterylnych przedmiotów i pracuj przy użyciu standardowych technik sterylności hodowli tkankowej podczas całej tej procedury.
3. Podgrzej wszystkie media do 37 °C.
4. Zlicz hodowane żywe komórki Jurkat.
5. Rozcieńczyć komórki Jurkat w pełnej pożywce do końcowego stężenia 1x10⁵ komórek/mL o końcowej objętości 14 mL.
6. Przenieść 2 mL 1x10⁵ komórek/mL do każdej z sześciu sterylnych probówek stożkowych o pojemności 15 mL.
7. Dodaj  MISSION^® roztwór cząstek lentiwirusowych do komórek Jurkat w taki sposób, aby końcowa krotność infekcji (MOI) wynosiła 0, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 lub 10 na probówkę stożkową. Wartość 0 MOI reprezentuje nietransdukowaną kontrolę ujemną.
8. Wiruj komórki z prędkością 800 x g przez 30 minut w temperaturze 32 °C.
9. Podłoże zawierające wirusa jest odsysane i usuwane w odpowiedni sposób zgodnie z wymogami instytucji.
10. Każdy osad komórkowy jest ponownie zawieszany w 2 ml pożywki poprzez delikatne pipetowanie osadu w górę i w dół, a każdy ponownie zawieszony osad jest przenoszony do własnej studzienki w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
11. Płytka jest ponownie umieszczana w inkubatorze do hodowli tkankowej na trzy dni.
12. Po 3 dniach przenieś komórki do 6 oddzielnych 15 ml probówek stożkowych i osuszaj je z prędkością 200 x g przez 5 minut. Usunąć pożywkę i zastąpić 2 ml kompletnej pożywki zawierającej puromycynę.
13. Płytkę do hodowli tkankowej umieścić z powrotem w inkubatorze na noc.
14. Komórki są utrzymywane w puromycynie do momentu śmierci nietransdukowanych komórek kontroli ujemnej, co określa się na podstawie kontroli lub barwienia błękitem trypanu.

Uwagi

Użyj poniższego równania do obliczenia MOI w studzience. Miano wirusa zostanie podane w certyfikacie analizy. VolumeofVirus to objętość w ml, która jest dodawana do studzienki/rurki wirówkowej zawierającej komórki do transdukcji. NumberofCells jest równa całkowitej liczbie żywych komórek w studzience/probówce wirówkowej.

MOI	=	Miano wirusa (TU/mL) x Objętość wirusa (mL)
		Liczba komórek

.

1. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. 2000. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Spinoculation Enhances Infection through Virus Binding. J. Virol.. 74(21):10074-10080. https://doi.org/10.1128/jvi.74.21.10074-10080.2000