Edycja genomu za pomocą nukleazy RNA CRISPR Cas 9

Na tej stronie:

Czym jest CRISPR/Cas9?
Jak działa CRISPR/Cas?
Jak działa CRISPR Cas9?
Co to jest CRISPR/Cas9?
Nasza rola w rozwoju CRISPR/Cas9

Co to jest CRISPR/Cas?

CRISPR to skrót od Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Odkrycie prokariotycznego "układu odpornościowego" CRISPR typu II pozwoliło na opracowanie prostego, łatwego i szybkiego do wdrożenia narzędzia do edycji genomu sterowanego RNA. Skrót CRISPR jest zwykle wymawiany jako słowo "crisper."

Jak działa CRISPR/Cas?

Ścieżka CRISPR została odkryta w bakteriach, gdzie działa podobnie jak układ odpornościowy przeciwko inwazyjnym wirusom i plazmidowemu DNA. Krótkie sekwencje DNA (odstępy) pochodzące z inwazyjnych wirusów są włączane do loci CRISPR w genomie bakterii i służą jako "pamięć" poprzedniej infekcji. Ponowna infekcja wyzwala komplementarny dojrzały RNA CRISPR (crRNA) w celu znalezienia pasującej sekwencji - co zapewnia nukleazie związanej z CRISPR (Cas) specyficzność do tworzenia dwuniciowego pęknięcia w określonych "obcych" sekwencjach DNA.

Rysunek 1. Genomowe miejsce docelowe

Jak działa CRISPR Cas9?

Aby stworzyć takie narzędzie, endogenny szlak CRISPR został zredukowany do dwóch głównych składników: nukleazy Cas9 i RNA-przewodnika (gRNA)^1-7. Przewodni RNA to dwuskładnikowy system składający się z crRNA i tracrRNA. CrRNA celuje w dwuniciowy DNA, który ma zostać przecięty, i ma krótki region homologii umożliwiający wiązanie tracrRNA.  TracrRNA zapewnia strukturę pętli macierzystej, która łączy się z białkiem Cas9. Dupleks crRNA:tracrRNA jest określany jako gRNA.  Nukleaza Cas9 i gRNA tworzą rybonukleoproteinę Cas9 (RNP), która może wiązać i przecinać określony cel DNA w kontekście całego genomu. Aby zostać rozciętym przez RNP, cel musi posiadać dwie określone sekwencje. Po pierwsze, gRNA wymaga 17-21 zasad homologii RNA-DNA, która nazywana jest protospacerem. Po drugie, białko Cas9 wymaga krótkiego sąsiadującego motywu protospacer (PAM), aby związać się z docelowym DNA (Rysunek 2).  Jeśli obecne jest łączące tracrRNA i istnieje wystarczająca homologia między gRNA a genomowym celem, RNP rozszczepia obie nici docelowego DNA, tworząc DSB w tym precyzyjnym miejscu w genomie. 

.

Rysunek 2. Schemat podwójnego przerwania nici ukierunkowanego na CRISPR/Cas.

Podczas gdy funkcjonalny CRISPR w jądrze ma postać RNP, elementy CRISPR jako narzędzia molekularnego nadają się do różnych metod dostarczania.  We wczesnych eksperymentach udało się stworzyć chimeryczny pojedynczy RNA prowadzący lub sgRNA, który łączy crRNA i tracrRNA w pojedynczą nić RNA, a nie dupleks występujący w naturze.Ten sgRNA i Cas9 mRNA mogą być wyrażane z pojedynczego plazmidu w celu bezpośredniej transfekcji lub pakowania w cząsteczki do transdukcji lentiwirusowej.  Alternatywnie, rekombinowane białko Cas9 można łączyć z syntetycznie wytwarzanym crRNA i tracrRNA w celu utworzenia RNP do transfekcji lub mikroiniekcji do zarodków.

Zamów SpCas9

Potrzebujesz pomocy przy użyciu białek Cas9?

Po ukierunkowanym utworzeniu DSB, komórka zazwyczaj wykorzystuje jedną z dwóch ścieżek naprawy DNA, aby przetrwać: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawa zależna od homologii (HDR). Te mechanizmy naprawcze często popełniają błędy, powodując mutagenezę w miejscu docelowym poprzez zakłócenie sekwencji kodującej w celu funkcjonalnej inaktywacji lub znokautowania genu (NHEJ) lub poprzez dodanie nowej sekwencji DNA w celu znokautowania określonych zmian sekwencji (HDR). W ten sposób system CRISPR/Cas9 umożliwia trwałe, dziedziczne modyfikacje chromosomalnego DNA. Ponadto, system CRISPR może być wykorzystywany jako ukierunkowany system dostarczania, gdy domeny endonukleazy Cas9 są inaktywowane i dołączane do innych cząsteczek efektorowych, aby działać w miejscu określonym przez gRNA w genomie.  Rozszerza to funkcje systemu CRISPR o aktywację i hamowanie genów. Wreszcie, system CRISPR może być wykorzystywany do badań przesiewowych. Wszystkie cztery podstawowe zastosowania systemu CRISPR/Cas9 - nokaut genów, nokaut genów, aktywacja lub hamowanie genów oraz badania przesiewowe - zostały omówione poniżej.

Znokautowanie genów

CRISPR/Cas9 generuje znokautowane komórki lub zwierzęta podczas koekspresji z gRNA specyficznym dla genu, który ma być celem. Celem nokautu genowego jest ujawnienie funkcji genu poprzez zakłócenie jego ekspresji w komórce. Współeksprymowany, odpowiednio zaprojektowany gRNA kieruje Cas9 do rozszczepienia sekwencji docelowej i wygenerowania DSB w interesującym genie. Znokautowanie genu można następnie osiągnąć na jeden z trzech sposobów: 1) komórka naprawia przerwę poprzez NHEJ, prowadząc do losowych insercji lub delecji ("indels") w otwartej ramce odczytu (ORF) odciętego genu; 2) komórka naprawia przerwę poprzez HDR z szablonu dostarczonego przez użytkownika, wstawiając określoną sekwencję zakłócającą do ORF; 3) para gRNA tworzy dwa DSB, które otaczają istotną sekwencję kodującą, powodując jej wycięcie.

NHEJ jest najbardziej aktywnym mechanizmem naprawczym, ale jest podatny na błędy i często wprowadza przesunięcie ramki, powodując przedwczesny kodon stop i / lub powodując, że powstały transkrypt jest ukierunkowany na rozpad za pośrednictwem nonsensu (NMD). Modyfikacje przesunięcia ramki mogą powodować przedwczesne wprowadzenie kodonów stop do transkryptu, uniemożliwiając translację krytycznych części łańcucha aminokwasowego, co skutkuje nieprawidłowo krótkim, niefunkcjonalnym białkiem. Funkcje rozpadu za pośrednictwem nonsensu mają na celu zmniejszenie błędów w ekspresji genów poprzez eliminację transkryptów mRNA, które zawierają przedwczesne kodony stop.  Teoretycznie ta ścieżka nadzoru jest aktywowana, gdy kompleksy połączeń ekson-ekson - kompleksy białkowe, które tworzą się na nici pre-mRNA między eksonami podczas składania RNA - nie są prawidłowo usuwane przez rybosom po złożeniu transkryptu. Gdy kompleks połączenia ekson-ekson pozostaje związany z powodu przesunięcia ramki w górę, transkrypt jest sygnalizowany do degradacji, a funkcjonalne białko nigdy nie jest tłumaczone. Obie te ścieżki są skuteczne w zakłócaniu funkcji genów w komórce.

Knock-in genów

CRISPR/Cas9 może być również używany do wprowadzania, lub "knock-in", nowych sekwencji DNA. Typowe modyfikacje obejmują wprowadzenie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP), małego znacznika, loxP lub większej kasety, takiej jak białko fluorescencyjne. Modyfikacje te są dokonywane poprzez DSB indukowane przez Cas9 w określonej lokalizacji, co znacznie zwiększa możliwości ukierunkowanej integracji. Ukierunkowana integracja (knock-in genu) zachodzi poprzez HDR. Aby umożliwić edycję genów za pomocą HDR, do komórki musi zostać dostarczony "dawca" DNA lub szablon naprawczy zawierający pożądaną sekwencję, zwykle na plazmidzie dawcy lub oligonukleotydzie, wraz z gRNA i Cas9. Skuteczność nokautowania genów jest ogólnie niższa niż w przypadku nokautowania (<10% zmodyfikowanych alleli), ale może być wykorzystywana do generowania określonych modyfikacji, od pojedynczej zmiany nukleotydu do dużych insercji.

Aktywacja i inhibicja genów

Oprócz funkcjonowania jako narzędzie do edycji genomu, CRISPR może być również wykorzystywany jako ukierunkowany system dostarczania innych funkcjonalnych białek. Unikalną cechą Cas9 jest jego zdolność do wiązania docelowego DNA niezależnie od rozszczepienia DNA, ponieważ są to dwa oddzielne etapy mechanizmu Cas9. Cas9 typu dzikiego posiada dwie domeny nukleazy: RuvC i HNH. Aby osiągnąć wiązanie bez rozszczepiania, obie domeny nukleazy są nieaktywne poprzez indukowanie mutacji punktowych (D10A i H840A w SpCas9), co skutkuje Cas9 bez nukleazy (dCas9). W połączeniu z gRNA ukierunkowanymi na miejsca startu transkrypcji odkryto, że sam dCas9 wystarcza do zmniejszenia lub zahamowania transkrypcji poprzez blokowanie inicjacji transkrypcji. Po tym odkryciu naukowcy zaczęli eksperymentować z represorami i aktywatorami transkrypcji związanymi z dCas9. Domena represora transkrypcji KRAB została połączona z dCas9 jako tryb wyciszania transkrypcji za pośrednictwem domeny efektorowej. dCas9 został również połączony z aktywatorami transkrypcji i białkami efektorowymi transkrypcji. dCas9 do aktywacji jest szeroko popularnym obszarem badań i obejmuje systemy takie jak dCas9-VP64, dCas9_SunTag, dCas9-SAM, dCas9-RNA Scaffold i dCas9-VPR.  W naszej ofercie produktów połączyliśmy dCas9 z katalityczną domeną rdzenia acetylotransferazy histonowej (HAT) ludzkiego białka P300 związanego z E1A. W połączeniu z gRNA ukierunkowanymi na miejsca startu transkrypcji i regiony wzmacniające, dCas9-P300 kieruje acetylacją histonów, uwalniając DNA ze stanu heterochromatycznego w celu zwiększenia ekspresji genów poprzez endogenną maszynerię komórkową w natywnym kontekście chromosomalnym. Podejście do acetylacji histonów dCas9-P300 stanowi odrębny mechanizm działania w stosunku do dCas9-VP64 lub innych podobnych motywów aktywacji genów. 

DCAS9P300

Screening<

Screeny umożliwiają szybkie badanie dużej liczby genów kandydujących lub miejsc genomowych pod kątem zaangażowania w interesujący nas szlak lub fenotyp. Ulepszenia w produkcji oligo w puli i obsłudze dużych ilości danych, w połączeniu z wydajnością dostarczania lentiwirusów, pozwalają badaczom na jednoczesne rozważenie tysięcy genów kandydujących, zarówno jako biblioteki, jak i bardziej ukierunkowanego panelu. Biblioteki definiujemy jako zbiory klonów CRISPR obejmujące cały genom; panele to mniejsze podzbiory genów. Ogólnie rzecz biorąc, panele i biblioteki mogą być montowane w dwóch formatach: pooled (tysiące gRNA w jednej probówce) lub arrayed (jedno gRNA na studzienkę w 96-dołkowych płytkach). Oba podejścia zapewniają szybkie odpowiedzi na większe pytania, oferując znaczące korzyści w porównaniu z wcześniejszymi metodami, które wymagały czaso- i pracochłonnego procesu przesłuchiwania genów kandydujących jeden po drugim.

Oferujemy różnorodne rozwiązania przesiewowe, w tym połączone biblioteki GeCKO z Broad i Sanger Arrayed Whole Genome Lentiviral CRISPR Library do wykonywania dużych ekranów nokautu genów(⁸). Wkrótce pojawią się również ludzkie i mysie biblioteki CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) do badań przesiewowych fenotypów aktywacji transkrypcji w całym genomie!

Biblioteka SAM

Co to jest CRISPR/Cas9?

Systemy CRISPR/Cas9 zostały odkryte w 1993 roku i wykazano, że wyewoluowały w organizmach bakteryjnych i archeologicznych jako obrona przed wirusami i obcymi plazmidami. Funkcja natywnego szlaku CRISPR polega na kierowaniu nukleaz do inwazyjnego DNA, tworząc potencjalnie śmiertelne pęknięcie dwuniciowe (DSB). Wkrótce po rozpoznaniu funkcji tego szlaku, system CRISPR/Cas9 typu II z bakterii Streptococcus pyogenes (SpCas9) został przeprogramowany w celu stworzenia prostego, ale potężnego narzędzia molekularnego, które można zaprogramować do kierowania nukleaz do określonej sekwencji genomowej.

Nasza rola w rozwoju CRISPR/Cas9

Jesteśmy dumni, że możemy zaoferować globalnej społeczności badawczej naszą najnowszą linię narzędzi do edycji genomu CRISPR. Jako pierwsza firma oferująca komercyjnie technologię ukierunkowanej edycji genomu prawie dziesięć lat temu, nikt nie ma większego doświadczenia w tej dziedzinie niż my. Doświadczenie to jest szczególnie ważne, jeśli chodzi o tworzenie narzędzi do edycji genomu, które spełniają krytyczne wymagania dotyczące specyficznego ukierunkowania i silnej aktywności cięcia. Zapewniamy obie te cechy w naszej nowej linii produktów CRISPR, a teraz oddajemy nasze umiejętności w Twoje ręce dzięki szybkiej i prostej internetowej platformie projektowej. Nasze produkty CRISPR można zamówić bezpośrednio przez poniższy link lub przejrzeć zawartość CRISPR na tej stronie, aby dowiedzieć się więcej o tej technologii.

Wszystkie gotowe do użycia plazmidy ekspresyjne Cas9 i Guide RNA (gRNA)

• Zoptymalizowane kodonowo białko Cas9 i gRNA ulegają ekspresji z jednego wektora i są dostarczane jako gotowe do użycia DNA do transfekcji.
• Unikalne miejsca CRISPR wstępnie zaprojektowane w celu zminimalizowania niecelowania są dostępne dla regionów kodujących genomów człowieka, myszy i szczura. Niestandardowe projekty dla innych regionów lub gatunków są zawsze dostępne na życzenie (patrz Formularz zapytania o niestandardowy CRISPR).
  
• GFP lub RFP są połączone z C-końcem Cas9 za pomocą peptydu 2A, umożliwiając śledzenie wydajności transfekcji i wzbogacanie aktywności edycji genomu poprzez sortowanie FAC.

Rysunek 3. Format pojedynczego plazmidu CRISPR/Cas

CRISPR Paired Nickases

.

• Sparowane nickazyCRISPR dodatkowo minimalizują dwuniciowe pęknięcia poza celem, wymagając niezależnego wiązania dwóch oddzielnych gRNA do zlokalizowanego regionu genomu.
• W obecności nukleazy niklującej Cas9-D10A, dwa gRNA indukują jednoniciowe pęknięcia na przeciwnych niciach DNA, tworząc funkcjonalne dwuniciowe pęknięcie.
• Wstępnie zaprojektowane, unikalne sparowane nicpazy CRISPR są dostępne dla regionów kodujących genomów człowieka, myszy i szczura (Paired Nickases Predesigns). Projekty dla innych regionów lub gatunków są dostępne na zamówienie (patrz Formularz zamówienia niestandardowego CRISPR).
• Przy zamawianiu sparowanych nicków CRISPR dla określonego celu, badacze otrzymają dwa oddzielne, gotowe do użycia plazmidy do transfekcji, wyrażające gRNA z ludzkiego promotora U6. Nukleaza Cas9-D10A musi być zakupiona oddzielnie jako plazmid lub mRNA.

Rysunek 4. Sparowane nickazy Cas9

Rysunek 5. CRISPR Cas3

Parowane nickazy Cas9 - W celu uzyskania optymalnej funkcjonalności sparowanej nickazy Cas9-D10A, prowadzące RNA powinno być zaprojektowane w orientacji 5'-do-5' z odstępami PAM pomiędzy 30 a 150 bp.

.

Purified RNA-only guide RNA

• Gotowe do użycia gRNA w formacie oczyszczonego RNA, odpowiednie do mikroiniekcji lub hodowli komórkowej.
• Zaprojektowane przy użyciu tych samych rygorystycznych zasad, co nasze plazmidy CRISPR i plazmidy CRISPR ze sparowaną nicią.
• Format CRISPR RNA jest idealny dla naukowców tworzących transgeniczne modele zwierzęce lub dla tych, którzy obawiają się integracji plazmidów genomowych.
• Format RNA pozwala uniknąć konieczności stosowania specyficznego promotora, umożliwiając ekspresję w większości znanych typów komórek i organizmów.
• Nukleazę Cas9 typu dzikiego (CAS9P) lub Cas9-D10A (CAS9D10AP) należy zakupić oddzielnie.) należy zakupić oddzielnie w postaci plazmidu lub mRNA (CAS9MRNA, CAS9D10AMRNA).
• Dostępne projekty dla dawców.

CRISPR Lentivirus

.

• Lentiwirus CRISPR do wysokowydajnych badań typu knockout
• Format lenti pozwala na wydajną integrację chromosomalną komponentów CRISPR.
• Transdukuj komórki przy użyciu naszego unikalnego formatu pojedynczego lentiwirusa CRISPR, który zawiera ORF Cas9 otoczony elementami puro i GFP, zapewniając wiele opcji monitorowania stabilnych populacji komórek.
• Umożliwia edycję genomu nawet w trudnych do transfekcji komórkach.
• Wybierz spośród naszych wstępnie zaprojektowanych miejsc CRISPR lub prześlij niestandardowe cele

Rysunek 6. Lentiwirusowy CRISPR: (A) Mapa wektorowa wektora all-in-one lenti CRISPR. (B) Sygnał GFP po transdukcji komórek HEK293 cząsteczkami wytworzonymi przez pLV-U6g-EPCG. (C) Komórki HeLa transdukowano lentiwirusem (pLV-U6g-EPCG), a następnie poddano selekcji puromycyną i 6TG w celu wzbogacenia o nokauty HPRT1. Insercje i delecje wykryto w miejscu docelowym gRNA za pomocą testu niedopasowania (CEL-I).

Pozytywne i negatywne kontrole CRISPR

• Przetestowana i zwalidowana kontrola pozytywna dla ludzkiego genu EMX1 stanowi podstawę odniesienia i umożliwia badaczom przeprowadzanie równoległych ocen skuteczności eksperymentów edycji genomu.
• Gotowe do użycia ludzkie kontrole pozytywne EMX1 dla obu pojedynczych gRNA (CRISPR01-1SET) oraz sparowanych nicków CRISPR (CRISPR02-1SET).
• Każda ludzka kontrola pozytywna EMX1 jest dostarczana z porcją dzikiego typu Cas9 (CRISPR01-1SET) lub nickase Cas9-D10A nuclease (CRISPR02-1SET).
• CRISPR Uniwersalne kontrole negatywne (CRISPR06-1EA, CRISPR07-1EA, CRISPR08-1EA) to gotowe do użycia plazmidy do transfekcji, wyrażające nukleazę Cas9 typu dzikiego pod promotorem CMV, wraz z sekwencją gRNA zaprojektowaną tak, aby celować w żaden znany ludzki, mysi lub szczurzy gen.

Rysunek 7. Obraz CEL I kontroli pozytywnej CRISPR01 (pas oznaczony EMX1s4+Cas9) i kontroli pozytywnej CRISPR02 (pas oznaczony EMX1s4, EMX1as4+D10A).

Referencje

1. Jinek M, East A, Cheng A, Lin S, Ma E, Doudna J. RNA-programmed genome editing in human cells. 2 https://doi.org/10.7554/elife.00471

2. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339(6121):823-826. https://doi.org/10.1126/science.1232033

3. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, et al. 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339(6121):819-823. https://doi.org/10.1126/science.1231143

4. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. 2012. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337(6096):816-821. https://doi.org/10.1126/science.1225829

5. Metzakopian E, Strong A, Iyer V, Hodgkins A, Tzelepis K, Antunes L, Friedrich MJ, Kang Q, Davidson T, Lamberth J, et al. 2017. Enhancing the genome editing toolbox: genome wide CRISPR arrayed libraries. Sci Rep. 7(1): https://doi.org/10.1038/s41598-017-01766-5

6. Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiácovo MP, Church GM, Calarco JA. 2013. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. 10(8):741-743. https://doi.org/10.1038/nmeth.2532

7. Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JJ, Joung JK. 2013. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31(3):227-229. https://doi.org/10.1038/nbt.2501

8. Bassett A, Tibbit C, Ponting C, Liu J. 2014. Highly Efficient Targeted Mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 System. Cell Reports. 6(6):1178-1179. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.03.017