Protokoły rybonukleoprotein (RNP) wykorzystujące syntetyczne sgRNA i białka Cas9

Zastosowania edycji genomu w oparciu o CRISPR RNP

Chociaż system CRISPR może być dostarczany do komórek za pośrednictwem plazmidów, bezpośrednie wprowadzenie Cas9 RNP wzmacnia i rozszerza zastosowania technologii modyfikacji genomu CRISPR, eliminując możliwość integracji plazmidowego DNA z genomem gospodarza. Kompleksy RNP oferują szybszą edycję genów, ponieważ funkcjonalna nukleaza jest natychmiast dostępna w komórce, a kompleksy są szybko degradowane i usuwane, dzięki czemu aktywność edycji jest krótkotrwała. Skrócony czas dostępności RNP w komórkach prowadzi do zmniejszenia efektów off-target.

Rysunek 1. Schemat jedno- i dwuczęściowego systemu CRISPR z białkiem Cas9, przedstawiający skład rybonukleoproteiny (RNP). Po utworzeniu pęknięcia dwuniciowego komórkowa maszyneria DNA podejmuje dwie możliwe ścieżki naprawy: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), tworzenie indeli lub naprawa ukierunkowana homologicznie (HDR) w przypadku ukierunkowanych insercji lub knock-inów.

Szczegółowe protokoły

Nasze syntetyczne przewodniki są kompatybilne z szerokim zakresem zastosowań edycji genów. Niezależnie od tego, czy potrzebujesz ogólnych wytycznych, nukleofekcji i mikroiniekcji zarodków, edycji komórek T czy protokołów iPSC. Możesz również znaleźć pomoc w ocenie wydajności rozszczepiania, izolacji i przesiewaniu klonów oraz rozwiązywaniu problemów.

Edycja pierwotnych komórek T przy użyciu RNP

Eksperymenty z edycją genomu oparte na rybonukleoproteinach (RNP) nigdy nie były łatwiejsze niż z syntetycznymi RNA i białkami Cas9 Sigma-Aldrich^®, jednak niektóre komórki mogą być trudniejsze do edycji niż inne. Dokładnie zweryfikowaliśmy nasze odczynniki i protokoły, aby działały w najtrudniejszych zastosowaniach, w tym w pierwotnych komórkach T, które stanowią szereg istotnych wyzwań, które należy pokonać, próbując znokautować lub znokautować konstrukt lub gen. Jednak dzięki sgRNA można osiągnąć edycję w pierwotnych ludzkich limfocytach T z wydajnością i specyficznością przewyższającą dwuczęściowe systemy prowadnic (Rysunek 2  poniższej karty danych) Zarówno w pierwotnych limfocytach T, jak i PBMC, Sigma-Aldrich^® sgRNA mogą być wprowadzane jako wysoce specyficzne sparowane nickazy i nickazy Cas9 lub jako białko SpCas9 w pojedynczym miejscu, aby uzyskać całkowity nokaut genu PD-1, mierzony ekspresją PD-1 i NGS (Rysunek 2  poniższej karty danych). Nukleazy sgRNA można szybko zaprojektować dla dowolnego genu jako pojedynczy docelowy RNA lub jako część sparowanego systemu nickazy, idealnego dla różnych typów komórek ludzkich, w tym pierwotnych komórek T. Nukleazy Cas dostarczane w formie białkowej, wstępnie skompleksowane z pojedynczym, zmodyfikowanym RNA prowadzącym (gRNA), a nie zakodowane na plazmidzie, pozwalają badaczom ominąć historyczne czynniki ograniczające stosowanie CRISPR w sferze terapeutycznej, takie jak efekty niecelowania, niska wydajność i niepożądane reakcje komórkowe na obce DNA. Gdy trzeba mieć pewność, Sigma-Aldrich^® sgRNA to jedyne prowadzące RNA, które są w pełni wspierane przez 100% gwarancję wydajności - wstępnie zaprojektowane i niestandardowe sekwencje.

Rysunek 2. Edycja za pomocą systemów RNP Nickase, z tylko jedną aktywną domeną tnącą, a następnie dostarczanie za pomocą proksymalnych prowadzących RNA w parze umożliwia precyzyjne przerwanie podwójnej nici i zapewnia hiperspecyficzną i wydajną edycję genomu w typach komórek, które są trudniejsze do edycji.

Sprawdzona wysoka wydajność edycji genów w zarodkach myszy

Tworzenie modeli mysich jest pracochłonnym i kosztownym procesem, ale ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań w zrozumieniu zdrowia i chorób. Wydajność sgRNA firmy Sigma-Aldrich^® została przetestowana na najwyższym poziomie pod kątem inżynierii genomowej w zarodkach myszy poprzez porównanie naszych sgRNA z innymi najlepszymi dostawcami w wielu miejscach genomowych w zarodkach myszy.

Wielokrotne powtórzenia w każdej lokalizacji w porównaniach obok siebie ujawniły różnice w skuteczności edycji między identycznymi celami sgRNA między Sigma-Aldrich^® sgRNA i innymi najlepszymi dostawcami. Eksperymenty przeprowadzone równolegle przez niezależny, wybitny ośrodek zajmujący się myszami wykazały wyższą wydajność pojedynczych prowadnic Sigma-Aldrich^® pod względem wydajności cięcia. Ponadto nie stwierdzono wzrostu toksyczności dla przeżywalności zarodków.Podsumowując, dane pokazują, że nasze wysoce aktywne i czyste sgRNA zapewniają doskonałą edycję genów w eksperymentach przeprowadzonych przez niezależny ośrodek w porównaniu do konkurentów niezależnych od mikroiniekcji lub elektroporacji zarodków.

Rysunek 3. Edycja genów w embrionach myszy jest tradycyjnie długim procesem, jednak edycja oparta na RNP z CRISPR zmniejsza złożoność. Modele mysie mogą być generowane szybko, dla niemal każdego celu. Nasze syntetyczne sgRNA nadają się zarówno do mikroiniekcji, jak i elektroporacji zarodków.

Powiązane produkty

Tabela 1: Produkty białkowe Cas9

Tabela 2: Inne powiązane produkty

EMBRYO CULTURE MEDIA	Mouse embryo culture media and mouse embryo tested reagents
KULTURA KOMÓRKOWA	Kompletny katalog komórek i odczynników do hodowli komórkowej

Rozwiązywanie problemów

Jeśli nie zaobserwowano cięcia i istnieje powód, aby podejrzewać, że przyczyną jest wada eksperymentalna, poniższe rozważania mogą pomóc w rozwiązywaniu problemów z eksperymentem.

Podejrzewany problem	Rozwiązanie
Białko Cas9 uległo denaturacji po długotrwałym przechowywaniu w buforze rozcieńczającym.	Dostarczony bufor rozcieńczający jest zalecany tylko do natychmiastowego użycia. W celu długotrwałego przechowywania, białko należy przechowywać w postaci liofilizowanej lub zawiesić w dostarczonym roztworze do rekonstytucji w temperaturze -20 ℃.
Białko Cas9 było rozmrażane i ponownie zamrażane zbyt wiele razy.
CrRNA i tracrRNA muszą zostać wyżarzone przed kompleksowaniem z białkiem Cas9.	Chociaż etap wyżarzania nie jest generalnie potrzebny, w rzadkich przypadkach wykazano, że zwiększa on cięcie. Aby wyżarzyć crRNA i tracrRNA, wymieszaj je w pożądanym stosunku i inkubuj mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 95 ℃, a następnie umieść mieszaninę na lodzie na 20 minut.
CrRNA i tracrRNA ulegają degradacji.	W normalnych warunkach hodowli komórkowej syntetyczne modyfikacje RNA nie są potrzebne do stabilizacji; jednak w przypadku niektórych linii komórkowych może to być konieczne. Modyfikacje są dostępne za naszym pośrednictwem.
Transfekcja lub nukleofekcja nie działa lub jest zbyt toksyczna.	Dla każdego odczynnika do transfekcji lub nukleofekcji należy zoptymalizować protokół dla każdej używanej linii komórkowej. W celu uzyskania dalszej pomocy należy zapoznać się z protokołem producenta.
In vitro transkrybowane RNA jest niskiej jakości lub zdegradowane.	W celu uzyskania optymalnej wydajności należy używać wyłącznie RNA IVT o zweryfikowanej jakości.