Protokół transdukcji lentiwirusowej

Następujący protokół został opracowany do badań przesiewowych o wysokiej zawartości w 96-dołkowych płytkach.

Materiały

• MISSION^® shRNA Lentiviral Transduction Particles
  
• Bromek heksadimetryny (Nr produktu. H9268)
  
• MISSION pLKO.1-puro Control Transduction Particles (Product No. SHC001V)
  
• MISSION shRNA Non-Target Control Transduction Particles (Product No. SHC002V)
  
• MISSION TurboGFP Control Transduction Particles (Product No. SHC003V)
  
• Minimum Essential Medium zawierająca 10% płodowej surowicy cielęcej lub pożywka wzrostowa zoptymalizowana dla konkretnej linii komórkowej
  
• 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych
  
• Komórki ssaków do transdukcji

Przygotowanie

Przygotuj komórki ssaków tak, aby rosły wykładniczo i były nie więcej niż 70-80% konfluentne przed transdukcją.

Przygotuj roztwór podstawowy bromku heksadimetryny o stężeniu 2 mg/ml w wodzie.

Metoda

Dzień 1

Dodaj 1.6 x10⁴ komórek w świeżej pożywce do liczby dołków potrzebnych dla każdego konstruktu na płytce 96-dołkowej. Powielić lub potroić studzienki dla każdego konstruktu lentiwirusowego i kontroli, które mają być użyte.
Inkubować 18-20 godzin w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze w atmosferze 5-7% CO₂.

Uwaga: Tempo wzrostu komórek jest bardzo zróżnicowane. Dostosuj liczbę umieszczonych komórek, aby uzyskać konfluencję 70% po transdukcji. Przy określaniu gęstości namnażania należy również wziąć pod uwagę czas, przez jaki komórki będą rosły przed dalszą analizą.

Dzień 2

Usuń pożywkę ze studzienek. Do każdego dołka dodać 110 µl pożywki i bromek heksadimetryny do końcowego stężenia 8 µg/ml. Delikatnie zawirować płytkę w celu wymieszania.

Uwaga: Bromek heksadimetryny zwiększa transdukcję większości typów komórek. Niektóre komórki, takie jak pierwotne neurony, są wrażliwe na bromek heksadimetryny. Nie należy dodawać bromku heksadimetryny do tych typów komórek. W przypadku pracy z danym typem komórek po raz pierwszy, w celu określenia wrażliwości komórek należy użyć tylko studzienki kontrolnej z heksadimetryną.

Dodaj 2-15 µL cząstek lentiwirusowych do odpowiednich studzienek. Delikatnie zawirować płytkę w celu wymieszania. Inkubować 18-20 godzin w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze w atmosferze 5-7% CO₂. Komórki można inkubować przez zaledwie 4 godziny przed wymianą pożywki zawierającej cząsteczki lentiwirusowe. Nocnej inkubacji można uniknąć, gdy toksyczność cząstek lentiwirusowych budzi obawy.

Uwaga: Podczas transdukcji konstruktu lentiwirusowego do linii komórkowej po raz pierwszy, należy przetestować zakres objętości lub MOI. 2, 5, 10 i 15 µL cząstek lentiwirusowych na 1,6 x 10⁴ komórek lub MOI wynoszące 1, 2 i 5 powinny być użyte do określenia optymalnej wydajności transdukcji i knockdown dla każdej linii komórkowej (patrz Dodatek). Wydajność transdukcji może być zoptymalizowana przy użyciu kontrolnych cząsteczek transdukcyjnych MISSION TurboGFP przed testowaniem z konstruktami shRNA.

Tabela 1 Objętość w µL do dodania do każdego dołka na płytce 96-dołkowej w zależności od miana wirusa. W tabeli przyjęto ~70 000 komórek na dołek. Miano wirusa lentiwirusowego można znaleźć w certyfikacie analizy dla każdej partii wirusa.

MOI	Lentiviral Titer (TU/mL)
	106.	107	108
0.5	35	3.5	0.35
1	N/A	7	0.7
2	N/A	14	1.4
5	N/A	35	3.5

Dzień 3

Usuń pożywkę zawierającą cząsteczki lentiwirusa ze studzienek. Dodaj świeżą pożywkę do objętości 120 µL do każdego dołka.

Uwaga: W przypadku typów komórek, które nie przylegają silnie do płytki, można usunąć 100 µL pożywki i zastąpić ją 100 µL świeżej pożywki.

Dzień 4 i kolejne

Wymieniaj pożywkę co 3-4 dni, aż komórki zostaną poddane testom.

Komórki mogą zostać wyselekcjonowane, a każdy klon może zostać rozszerzony w celu przeprowadzenia testu ekspresji shRNA.

Można przeprowadzić różne testy fenotypowe, enzymatyczne lub ekspresji genów. Pożądany test powinien zostać zoptymalizowany przed badaniem przesiewowym o wysokiej zawartości, zarówno z kontrolą negatywną, jak i pozytywną.

Uwaga:Z powodu losowej integracji lentiwirusa z genomem gospodarza, różne poziomy ekspresji TurboGFP lub shRNA mogą być obserwowane w różnych koloniach. Testowanie wielu kolonii pozwoli na określenie optymalnego stopnia ekspresji.

Dodatek

Multiplicity of Infection (MOI): Mnogość infekcji to liczba transdukujących cząstek lentiwirusowych na komórkę. Zaleca się, aby dla każdego nowego typu komórek, które mają być transdukowane, przetestować zakres MOI. Pozwoli to określić optymalną ilość supernatantu lentiwirusowego potrzebną do skutecznej transdukcji każdej używanej linii komórkowej.

Obliczanie:

(Całkowita liczba komórek na studzienkę) x (Pożądane MOI) = Wymagane całkowite jednostki transdukujące (TU)

(Wymagane całkowite TU) / (TU/mL podane w C of A) = Całkowity ml cząstek lentiwirusowych do dodania do każdej studzienki

Odniesienie

1. Li M, Rossi JJ. 2007. Lentivirus Transduction of Hematopoietic Cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2007(10): https://doi.org/10.1101/pdb.prot4755