Sekwencjonowanie
Możliwość określenia składu i kolejności kwasów nukleinowych w nici DNA lub RNA ma głębokie implikacje dla zrozumienia współczesnej genetyki i wielu dziedzin, które są niezbędne do badań nad chorobami i lepszego zrozumienia wszystkich organizmów. Zdolność do sekwencjonowania kwasów nukleinowych jest nie tylko przydatna do rozszyfrowania kodu genetycznego organizmu, ale także zapewnia naukowcom potężne narzędzie, w połączeniu z dodatkowymi technologiami molekularnymi, do łatwego manipulowania sekwencjami DNA i weryfikacji tych zmian poprzez sekwencjonowanie. Ponieważ kodujące DNA funkcjonuje jako zakodowana informacja dla białek, naukowcy mogą teraz projektować na zamówienie rekombinowane białka, które zawierają dużą różnorodność elementów funkcjonalnych i są szeroko stosowane w celu udzielenia odpowiedzi na równie dużą liczbę ważnych pytań badawczych. Dodatkowe odczynniki i przewodniki dotyczące sekwencjonowania całogenomowego można znaleźć na stronie Next-Generation Sequencing resource.
Sekwencjonowanie Sangera
Wcześniej metody chemii analitycznej były w stanie określić skład kwasów nukleinowych. Jednak Fred Sanger i współpracownicy opracowali metody - początkowo wykorzystujące trawione fragmenty znakowane radioaktywnie i dwuwymiarowe frakcjonowanie - aby zapewnić jedne z pierwszych kompletnych sekwencji nukleinowych. Postępy w tej dziedzinie trwały przez kilka dziesięcioleci, a każde ulepszenie dodawało do rosnącej biblioteki sekwencjonowanych białek i genomów. Ulepszenia te obejmują rozdzielanie nukleotydów według długości za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie elektroforezy kapilarnej. Dodatkowo, włączenie fluorescencyjnie znakowanych nukleotydów i zautomatyzowana analiza komputerowa każdego fragmentu kwasu nukleinowego definiują obecnie nowoczesną metodę sekwencjonowania Sangera.
Metodologia sekwencjonowania DNA
Chociaż metody sekwencjonowania DNA były stale ulepszane od czasu powstania tej technologii, kilka podstawowych elementów jest nadal niezbędnych i wykorzystywanych przez nowoczesne platformy sekwencjonowania DNA. Przygotowanie DNA zazwyczaj obejmuje izolację i oczyszczanie DNA z organizmu gospodarza. Dodatkowe krytyczne składniki, w tym wolne zasady DNA, startery DNA, zmodyfikowane zasady DNA zawierające znaczniki fluorescencyjne (zasady terminatora) i polimeraza DNA są dodawane razem do jednego naczynia. Naczynie zawierające wszystkie te składniki poprzez serię etapów ogrzewania i chłodzenia wytworzy bibliotekę małych sekwencji DNA w stosunku do sekwencji DNA o pełnej długości, z których każda kończy się fluorescencyjnie znakowaną końcową zasadą terminatora. Nowe nici DNA zawierające fluorescencyjnie znakowane końcowe nukleotydy są rozdzielane według długości, przepuszczane przez rurkę kapilarną i układane według rozmiaru. Laser jest następnie używany do wzbudzenia fluorescencyjnej zasady na każdej nici, podczas gdy kamera rejestruje sygnał. Wreszcie, komputer jest zwykle używany do składania zebranych informacji w sekwencję DNA o pełnej długości.
Powiązane artykuły techniczne
- Zestaw Sigma-Aldrich® T7E1 do wykrywania niedopasowania pozwala łatwo zweryfikować eksperymenty edycji genów CRISPR, zapewniając udaną edycję.
- Zastosowanie oligos modyfikowanych lipidami MULTI-seq, protokół i przewodnik rozwiązywania problemów dla testów PCR i aplikacji sekwencjonowania.
- An ultrafiltration cartridge can be placed at the outlet of a water purification system to deliver nuclease-free ultrapure water.
- Expression of the Multiple Sclerosis-Associated MHC Class II Allele HLA-DRB1*1501 Is Regulated by Vitamin D
- Next-generation sequencing (NGS) revolutionized genomic research, and is now playing a crucial role in the clinical environment.
- Zobacz wszystkie (9)
Powiązane protokoły
- Dowiedz się więcej o etapach sekwencjonowania Sangera lub metodzie zakończenia łańcucha oraz o tym, jak działa sekwencjonowanie DNA i jak dokładnie odczytywać wyniki sekwencjonowania Sangera na potrzeby badań.
- Zobacz wszystkie (2)
Znajdź więcej artykułów i protokołów
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?