중합효소연쇄반응(PCR) 애플리케이션

중합효소연쇄반응(PCR)은 강력한 주요 분자생물학 기술이며 다양한 출처의 특정한 DNA 및 RNA 염기서열을 위한 효율적이고 신속한 in vitro 방법입니다. 표준 PCR은 표적 DNA, 표적 DNA 서열을 둘러싸는 합성 올리고핵산 프라이머 한 세트, 내열성 DNA 중합효소(일반적으로 Taq polymerase) 그리고 뉴클레오티드로 구성됩니다. 유전자증폭장치(thermal cycler)를 사용하는 각각의 증폭 주기 동안 세 개의 단계 즉, 이중 사슬 DNA(dsDNA)를 별도의 단일 사슬 DNA로 변성(denaturing), 표적 DNA 서열에 프라이머 결합(annealing) 그리고 신장(extension)이 포함되며, 여기에서 DNA 중합효소가 프라이머로부터 DNA를 신장하여 한 개의 기존 사슬과 한 개의 신규 사슬로 새로운 dsDNA를 생성합니다. 한 단계에서 합성된 사슬은 다음 단계에서 주형(template)의 역활을 하여, 고작 20개 주기에서 DNA의 양이 백만배 증가하는 결과를 가져옵니다.  

역전사효소 PCR(RT-PCR)

RT-PCR 또는 역전사효소 PCR은 표준 PCR 기술의 변형이며 상당히 소량의 시료에서 얻은 특정 mRNA의 증폭을 포함합니다. 이는 기존 클로닝 기법에서 요구되는 긴 시간이 필요한 mRNA 정제 과정의 필요성을 제거합니다. RT-PCR을 이용하면, 역전사효소 및 RNA 시료를 표준 PCR 시약에 추가로 사용합니다. 반응 혼합물을 37 ˚C까지 가열하면, 역전사효소에 의해 RNA 시료로부터 상보적인 cDNA 복사본이 생산됩니다. 이러한 cDNA는 프라이머에 결합하여 최초 사슬 합성을 이끌어 냅니다. 여기서부터 표준 PCR을 따르며 최종적으로 dsDNA가 생성됩니다. RT-PCR은 실시간 PCR(qPCR)와 종종 결합되어, 세포 및 조직에서 전사물(transcript) 수준을 정량하기 위해 널리 활용됩니다.

핫스타트(hot start) PCR

핫스타트 PCR은 열 활성화 단계가 발생할 때까지 핫스타트 Taq 중합효소 또는 반응 설정 동안 변형된 dNTPs의 통합을 억제하는 기술입니다. 핫스타트 중합효소 활성을 정시시키기 위한 여러가지 방법이 있으며, 화학적 변형, 항체 주도형 및 압타머(aptamer) 주도형 방법이 포함됩니다. 

긴 표적의 정확한 증폭을 위한 앤드포인트(Endpoint) PCR

앤드포인트 PCR 반응은 완료된 시점에서 표적의 존재 및 상대적 풍부성을 검출하기 위해 자주 사용됩니다. 표준 PCR에서 생성되는 서열의 길이 제한인 약 5 kb는 “교정” 활성을 제공하는 추가적인 요인을 통합하여 부분적으로 극복할 수 있습니다. 롱 앤드 애큐레이트(Long and accurate, LA) PCR은 3′→5′ 핵산단말분해효소가 있는 두 번째 내열성 중합효소를 사용하여 종말 뉴클레오티드 오편입(misincorporation)을 수리하므로, 크게 향상된 신뢰성과 최대 길이 40 kb의 표적 DNA를 증폭하는 능력의 결과를 낳습니다.