DIG Northern Starter Kit （製品番号12039672910）は、DIGシステムを初めて使う場合の理想的な製品です。本キットに含まれる試薬により、正確で再現性のある結果をノーザンブロットで得ることができます。また、便利な形態の標準的DIGシステム製品が同梱されています（例： ready-to-use のCDP Starなど）。研究者は、DIGシステムを用いて少ない回数の反応でしっかりとした基礎を作ることができます。理想的な成功を得るには、本キットを DIG Wash and Block Buffer Set と共にご使用ください。このキットは一本鎖の、DIG標識RNAプローブを生成し、化学発光検出のために用いられます。標識プローブはin vitro転写法を用いて合成されます。
DNAプローブをRNAターゲットにハイブリダイズ
一般に、ノーザンブロットではDNAプローブを使用することが可能です（PCRまたはランダムプライミングによるDNAプローブ）。ただし、DNAプローブは、ハウスキーピング遺伝子などの多量のメッセージの検出に最も適しています。ノーザンブロットのDNAプローブと比較して、得られるシグナルが強く、非特異的ハイブリダイゼーションが少ないため、希少なmRNAの検出にはDIG標識RNAプローブを使用してください。通常は、可能な限りRNAプローブを使用することをお勧めします。
DIG標識アンチセンスRNAプローブは、基本的に次の2通りの方法で調製できます。
- 目的の遺伝子のcDNAクローンを使用する標準的な方法：アンチセンスプローブを作製するには、サブクローンの5'末端を適切な制限酵素で直鎖状にし、3'末端にあるRNAポリメラーゼのプロモーターを使用します。
直線化には、5'オーバーハング末端を作製する制限エンドヌクレアーゼを使用してください。 - または、テンプレートとしてのPCRフラグメントからin vitro転写を実行します。
分析のための一般的なヒント
最良の結果を得るには、次の量のターゲットRNAをゲルにロードします。DNAプローブの場合は最大5 µgのトータルRNAまたは500 ngのmRNA（25 ng/mLのハイブリダイゼーションにおけるDIG-DNAプローブ濃度）、RNAプローブの場合は最大1 µgのトータルRNAまたは100 ng mRNA（50～100 ng/mLのハイブリダイゼーションにおけるDIG-RNAプローブ濃度）
PCR産物からのDIG標識RNAプローブの生成
PCRプライマーを使用して適切なRNAポリメラーゼのプロモーター配列を直接付加できます。詳細な実験プロトコルについては、添付のTechnical Tipをお読みください。
DIGノーザンブロットのトラブルシューティング
メンブレンの剝離
RNAはアルカリに対して不安定で破壊されるため、ノーザンブロットではアルカリストリッピング処理を用いないでください。
ノーザンブロットに現れる白いバンド
DIGシステムは高感度の検出方法であるため、RNAプローブと組み合わせて1 µgを超えるトータルRNAをロードしないでください。ロードされたターゲットが多すぎると、ポジティブブロッキング効果が生じ、黒い背景に白いバンドシグナルが現れます（この「ブロッキング効果」は内在性のタンパク質汚染によって引き起こされます）。
in situハイブリダイゼーション（ISH）におけるコントロールの使用
基質だけを切片とインキュベートすることによってネガティブコントロールを実行しても、バックグラウンドの問題は発生しません。さらなるネガティブコントロールとは、センスプローブを使用して、またはプローブを使用せずに、アンチセンスプローブと並行してISH手順全体を実行してから、抗体結合を含む検出プロセス全体を実行することです。これらのテストの結果からは、使用したアンチセンスプローブが粘着性である（非特異的にハイブリダイズしている）かどうかがわかります。
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