DIG RNA標識キット（SP6／T7）のプロトコルとトラブルシューティング

製品番号11175025910

プロトコル

DIG RNA標識効率の評価：
µg単位で標識効率を判定します（標準的な標識反応の予想収量は、DIG RNA標識反応後の線形化されたテンプレートDNA 1 µgあたり20 µgのDIG標識RNAです）。
Rocheは、アガロースゲルに分取サンプルをロードすることを推奨しています。RNA転写産物は、アガロースゲル電気泳動（ホルムアルデヒドゲルやネイティブゲルなど）と臭化エチジウム染色を使用して分析できます。

注記：RNAプローブで完全性を検証することはできますが、ゲル電気泳動による定量化は行えません。

発現ベクターにサブクローニングすることなく、PCR産物からDIG標識RNAプローブを直接生成：
これは、適切なRNAポリメラーゼのプロモーター配列がPCRプライマーに直接含まれている場合に可能です。
詳細な実験プロトコルについては、添付のテクニカルヒントをお読みください。

テンプレート特性：
転写反応における環状またはニックの入ったプラスミドDNAは、転写を妨害し、効率を低下させ、非特異的な転写物を生成する可能性があります。制限酵素消化が完全であることの確認には、精製されたプラスミドDNAのみを使用するのが最適です。最良の結果を得るため、高純度プラスミド分離キットを使用してください。DNA 1μgあたり10ユニットの制限酵素を使用し、少なくとも3時間消化します。テンプレートが高純度であり、塩、タンパク質、RNAseなどの汚染物質を含んでいないことが非常に重要です。最良の結果を得るには、直鎖状のテンプレートをゲル精製し、スピンカラム（高純度PCR産物精製キット）を使用してさらにクリーンアップします。または、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿を実行することも可能です。テンプレートDNAをRNAseフリーの水（水、PCRグレード）に再懸濁し、ゲル上の分取サンプルのサイズ、純度、濃度を確認し、1 µgのテンプレートをin vitro転写反応に使用します。

トラブルシューティング

合成されたリボプローブの長さ - ゲル電気泳動での分析 - 複数のバンドが生じる場合の考えられる原因：

可能性1：
非変性条件（単純なアガロースゲル）下では、二次RNA構造が分解されず、2つのバンドが生じることがあります。確認するには、MOPS／ホルムアルデヒドゲル（ノーザンブロットゲルで一般的に使用）またはPAGEを使用します。

可能性2：
RNAプローブの生成に使用されるテンプレートDNAは、DNAse消化ステップが実行されなかった場合でも、ゲルにロードされた分取サンプル内にわずかな量で存在します。DIG RNA標識キットに付属のコントロールを使用する場合、キットに含まれるDNA断片の詳細については、添付文書を参照してください。

可能性3：
使用するDNAコンストラクトに応じて、5'オーバーハングを線形化に使用できることが推奨されます。
DIG標識反応後に、ゲル電気泳動で結果をチェックし、転写産物が予想されるサイズになっていることを確認します。DNA配列の中には、不完全な転写物や短い転写物がRNAポリメラーゼによって生成される原因となるものがあります。これらの問題を解決するには、ポリリンカーの反対方向のベクターに再クローニングし、同じDNA鎖を別のRNAポリメラーゼで転写するか、テンプレートDNAのもう一方の鎖を転写します。

3'オーバーハングまたは平滑末端を持つDNAテンプレートは、「 run on 」転写によって引き起こされる「間違った」DNA鎖の不要な転写物を生成する可能性があります。この問題を避けるため、5'オーバーハング末端を作製する制限酵素を使用してください。