DIG Easy Hyb™ Granulesプロトコル＆トラブルシューティング

製品番号11796895001

プロトコル

DEPC処理水の使用

DEPC（炭酸ジエチル）は化学薬品供給業者に注文することができます（例えば カタログ番号D5758）。DEPCはRNaseフリー水を生成するために使用されます。RNasesは、オートクレーブに耐えうる極めて安定な酵素です。

ドラフトチャンバー内で、撹拌中にDEPC 1 mLを脱イオン蒸留水1 Lに添加します。少なくとも2時間撹拌します。DEPC水を20～30分オートクレーブ処理し、残留DEPCを蒸発させます。室温（+15～+25℃）まで冷却させると、この水はすぐに使用可能となります。RNAin situ ハイブリダイゼーションについて、Rocheはすべての水性溶液調製にDEPC処理水の使用を推奨しています。

注記：  In vitro 転写反応におけるmRNAの保護において最良の結果を得るためには、RocheのプロテクターRNaseインヒビターを使用します。

DEPC水での再構成

DIG Easy Hyb™ Granulesは、慎重に無菌再蒸留水64 mLを添加することにより再構成し、2つに分けてプラスチック製ボトルに入れ、速やかに37℃で5分攪拌し溶解します。ノーザンブロットを用いたアプリケーションでは、DIG Easy Hyb™ GranulesはDEPC水を用いてRNaseフリー条件下で溶解する必要があります。64 mLの容量はプラスチック製ボトルにちょうど収まる量です。便宜上、64 mLを2つに分けます。Granulesは、RTで一晩の間に溶解可能です。最良の結果を得るためには、溶液中のDIG Easy Hyb™ Granulesに対しオートクレーブ処理を行いません。

また、簡便ですぐに使用できるDIG Easy Hyb™溶液はRocheから入手可能です。

トラブルシューティング

添加剤はハイブリダイゼーション感度を亢進しません

[³²P]-標識プローブについては、ハイブリダイゼーションバッファーへの添加剤はハイブリダイゼーション感度を亢進することができると報告されています。例えば、10%デキストラン硫酸塩または6～10% PEG 8000はハイブリダイゼーション感度を2～3倍亢進することができます。

しかしながら、Rocheでの検査はデキストラン硫酸塩またはPEGのDIG Easy Hyb™バッファーへの添加はDIG-標識プローブの感度を亢進しないことを示しています。両製品のロット間の変動が大きいため、Rocheはデキストラン硫酸塩またはPEGとDIG Systemとの併用を推奨しません。一般的に、最良の結果を得るためには、DIG Easy Hyb™バッファーにサプリメント添加はしません。非放射性ハイブリダイゼーション実験に供給されたものとして使用します。