NBT結晶プロトコルのトラブルシューティング

5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（BCIP）と組み合わせたニトロブルーテトラゾリウム（NBT）クロリド結晶（製品番号11585029001）は、サザンブロット、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、コロニーおよびプラークリフト、in situハイブリダイゼーションなどのブロッティングプロトコルでのアルカリホスファターゼ（AP）の高感度検出に加え、免疫組織化学および免疫細胞化学への応用に最適です。NBT／BCIPは、ニトロセルロースとナイロンメンブレンの両方に使用できます。

プロトコルのトラブルシューティング

対比染色

• FastGreen FCFやNuclear Fast Redなど、BM Purple（または一般的にはNBT／BCIP）との併用が可能な対比染色がいくつかあります。詳細については、Rocheの『DIG Application Manual for Nonradioactive in situ Hybridization』に示すプロトコルを参照してください。

封入剤

• キシレン含有封入剤（DPXなど）は、呈色沈殿の結晶形成につながる可能性があるため、NBT／BCIPシグナルの封入に使用しないでください。ただし、エオシンなどの従来の対比染色には、キシレンを含んだ封入剤が必要となります。
• NBT／BCIPシグナルのある切片を封入するための封入剤として市販されている製品には、Biomedia製Crystalmountのほか、Vector Laboratories製VectamountまたはImmunomountが挙げられます。また、これらの封入剤と互換性のある有機対比染色（Vector Methyl Green、Vector Nuclear Fast Redなど）も、それぞれ同じメーカーから提供されています。
• 特定の対比染色を任意の封入剤と併用した結果は、主にNBT／BCIP色検出に使用される組織の種類によって決まります。
• NBT／BCIP検出を行うかどうかにかかわらず、隣接するスライドの染色には一般的な対比染色を用い、封入には従来のキシレン含有封入剤を使用します。こうすることで、シグナルの有無にかかわらず、染色された組織を直接比較できるようになります。
• 一部の組織（心臓切片など）は、脂肪滴を細胞内に蓄積する可能性があります。凍結切片にアルカリ性リン酸塩（NBT／BCIP）による検出法を用いると、呈色沈殿の一部がこれらの脂肪滴に滞留することがあります。この問題は、プレハイブリダイゼーションの前に、これらの切片をクロロホルムで脱脂（室温で10分間）することによって解決できます。

沈殿物

• ストック溶液中の沈殿物は、加温して軽く振とうすることで溶解できます。ピペット操作を行う前に、スピンダウンして最上層から取り除いてください。
• 検出バッファーのpHをpH 9.5の範囲（20℃時）に収め、検出溶液の空気への暴露を最小限に抑える必要があります（気密コプリンジャー）。

一般青色の高バックグラウンド

• NBT／BCIPを使用した一般的な非特異的な高バックグラウンドは、組織の過固定によって引き起こされると考えられます。過固定は通常、組織全体の一般青色染色の原因となります。このバックグラウンドが特異的シグナルと干渉することはありません。

青色ではなく茶／紫シグナルで染色される

• in situハイブリダイゼーションでは、NBT／BCIP呈色沈殿の色が青から茶または紫に変化することがあります。最終的な色は、主に組織内のターゲットmRNAの量によって決まりますが、プローブの長さと標識強度にも左右されます。また、検出溶液（アルカリホスファターゼの反応バッファー）のpHも影響する可能性があるため、pH 9.5に慎重に調製することが必要です。
• 一般的に、ターゲットRNAの量が多いほど、シグナルが強くなり、呈色沈殿の青色が濃くなります。
• BM紫基質では濃い青色または紫色のシグナルが現れます。
• スライドの端からの乾燥は、非特異的なバックグラウンドを発現させる可能性があります。