Rozwiązywanie problemów z elektrotransferem półsuchym lub w zbiorniku

Elektrotransfer odnosi się do standardowej procedury przenoszenia białek z żelu poliakrylamidowego (SDS-PAGE) na membranę transferową PVDF firmy Immobilon^®. Dwie powszechnie stosowane techniki elektrotransferu to transfer w zbiorniku i transfer półsuchy. Obie opierają się na tych samych zasadach i różnią się jedynie urządzeniami mechanicznymi używanymi do utrzymywania stosu żel/membrana i zastosowaniami pola elektrycznego.

Kliknij na objawy elektrotransferu półsuchego lub zbiornikowego, aby przeczytać o możliwych przyczynach i środkach zaradczych:

• Band Smeared/Distorted
  
• Wysokie tło w detekcji fluorescencyjnej
  
• Brak sygnału
  
• Słaby transfer białek o małej masie cząsteczkowej
  
• Poor Transfer of Large Molecular Weight Proteins (~ >80 kDa)
  
• Poor Transfer of Positively Charged Proteins
  
• Poor Semi-Dry Transfer
  
• Słaby transfer szerokiego zakresu wielkości białek
  

Band Smeared/Distorted

Możliwa przyczyna	Recepta
Membrana nie jest równomiernie zwilżona metanolem	Cała membrana musi być wstępnie zwilżona metanolem; cała membrana powinna zmienić się równomiernie z nieprzezroczystej w półprzezroczystą.
Pęcherzyki powietrza pod membraną i pomiędzy innymi warstwami w stosie . Efekt pęcherzyków powietrza pomiędzy żelem a membraną podczas transferu Western blot	Używając pipety lub mieszadła, delikatnie rozwałkuj wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza podczas składania stosu.
Nierówny kontakt między żelem a membraną	Upewnij się, że cała powierzchnia żelu i membrany jest w dobrym kontakcie.
Zbyt dużo ciepła generowanego podczas transferu	Temperatura przebiegu nie powinna przekraczać 20 °C. W przypadku transferu w zbiorniku należy wstępnie schłodzić bufor lub przeprowadzić transfer w chłodni. W przypadku transferu półsuchego należy skrócić czas pracy, zwiększyć liczbę bibuł filtracyjnych lub zmniejszyć natężenie prądu.
Wysuszenie bibuły filtracyjnej podczas transferu półsuchego	Upewnij się, że bibuła filtracyjna została dokładnie zmoczona przed transferem lub użyj dodatkowych arkuszy. Należy upewnić się, że stos zostanie złożony w czasie krótszym niż 15 minut.
Białka przeniesione zbyt szybko; nagromadzenie białka na powierzchni membrany	Zmniejsz siłę pola elektrycznego.

Wysokie tło w detekcji fluorescencyjnej

Prawdopodobna przyczyna&	Remedycja
Autofluorescencja z membrany transferowej	Do transferu użyj membrany o niskiej autofluorescencji, takiej jak membrana Immobilon®-FL. Odwrotny obraz demonstrujący fluorescencyjną detekcję transferyny w ludzkiej surowicy na różnych transferach Western blot
Białka przechodzące przez membranę	Zwiększenie czasu interakcji białek z membraną poprzez zmniejszenie napięcia nawet o 50%. Białka o wysokim ładunku ujemnym (ze względu na wysoką zawartość kwasu asparaginowego i glutaminowego) mają tendencję do poruszania się bardzo szybko w polu elektrycznym. Zmniejsz napięcie, aby spowolnić migrację tych białek. Obecność SDS w żelu może hamować wiązanie białek. Wyrównaj żel w buforze transferowym przez co najmniej 15 minut Żel (góra) i blot (dół) pokazują, że equilibration poprawia wydajność transferu dla Western blot. Stężenie metanolu w buforze transferowym jest zbyt niskie, aby ułatwić usuwanie SDS. Zwiększ stężenie metanolu do 15 - 20%, szczególnie dla białek o mniejszej masie cząsteczkowej. Membrana musi być wstępnie zwilżona metanolem; cała membrana powinna zmienić się równomiernie z nieprzezroczystej na półprzezroczystą. Przełącz się na membranę transferową Immobilon®-PSQ.
Białka zatrzymane w żelu	Jeśli stężenie metanolu w buforze transferowym jest zbyt wysokie, może on usunąć SDS z białek i doprowadzić do wytrącenia białka w żelu. Zmniejszyłoby to transfer białek o dużej masie cząsteczkowej z żelu. Jeśli wytrącanie białek jest problemem, bufor transferowy można uzupełnić SDS (0,01% - 0,05%), aby zwiększyć rozpuszczalność. Ponadto nadmiar metanolu może mieć tendencję do kurczenia się lub zacieśniania żelu, hamując w ten sposób transfer białek o dużej masie cząsteczkowej.
Punkt izoelektryczny białka jest równy lub zbliżony do pH buforu transferowego	Białko, które ma taki sam punkt izoelektryczny jak pH buforu transferowego, nie będzie miało ładunku netto, a zatem nie będzie migrować w polu elektrycznym. Aby ułatwić transfer, wypróbuj bufor o wyższym pH, taki jak 10 mM bufor CAPS o pH 11, w tym 10% metanol lub bufor o niższym pH, taki jak bufor kwasu octowego.
Słaba wykrywalność, gdy mocznik jest używany w żelu i/lub buforze transferowym	Obniż temperaturę za pomocą buforu cyrkulacyjnego lub przeprowadź transfer w zimnym pomieszczeniu. Mocznik w obecności ciepła może powodować karbamylację białek, co może zmienić ładunek aminokwasów w białku. Może to wpłynąć na epitopy niezbędne do rozpoznawania i wiązania przeciwciał.
Niekompletny transfer białek	Stain the gel to check for residual proteins. Jeśli transfer nie był kompletny, sprawdź technikę transferu.
Słaba retencja białek	Po zakończeniu transferu należy upewnić się, że membrana jest całkowicie sucha, aby uzyskać optymalne wiązanie i utrwalenie białek. Należy to zrobić przed zastosowaniem jakiejkolwiek metody wykrywania.

Brak sygnału

.

Prawdopodobna przyczyna          ;	Remedycja
Brak transferu białek	Sprawdź orientację żelu i membrany podczas procesu transferu. Używaj wstępnie zabarwionych wzorców masy cząsteczkowej do monitorowania transferu.

Poor Transfer of Small Molecular Weight Proteins

.

Możliwe Cause	Remedycja
Niewystarczająca retencja białek SDS zakłóca wiązanie białek o małej masie cząsteczkowej	Przełącz na Immobilon®-PSQ membranę transferową. Usuń SDS z roztworu transferowego.
Niskie stężenie metanolu w buforze transferowym	Użyj wyższego procentu metanolu (15% - 20%) w buforze transferowym.
Niewystarczający czas wiązania białka	Niższe napięcie może zoptymalizować wiązanie małych białek do membrany.
Prąd nie przechodzi przez membranę	Przyciąć membranę i bibułę dokładnie do rozmiaru żelu; nie dopuszczać do zwisów. Sprawdź wstępnie przycięte kanapki z membraną i bibułą filtracyjną

Słaby transfer białek o dużej masie cząsteczkowej (~80 kDa)

Prawdopodobna przyczyna                             nbsp;	Remedycja
Stężenie metanolu jest zbyt wysokie	Zmniejszenie stężenia metanolu do 10% (v/v) lub mniej powinno pomóc w przenoszeniu białek o dużej masie cząsteczkowej, umożliwiając pęcznienie żelu. Co więcej, niższy procent metanolu zmniejszyłby również utratę SDS z białek i zmniejszyłby wytrącanie białek w żelu. Białka o masie 200 kDa nie są tak wrażliwe na zakłócenia SDS w wiązaniu z błoną jak białka o masie 100 kDa.

Poor Transfer of Positively Charged Proteins

.

Prawdopodobna przyczyna	Remedycja
Ładunek netto białka w buforze transferowym jest dodatni; białka poruszają się w kierunku katody.	Odwróć stos transferowy tak, aby membrana transferowa Immobilon® znalazła się po stronie katody żelu.

Poor Semi-Dry Transfer

.

Możliwa przyczyna	Przyczyna
Prąd omija stos żelu	Upewnij się, że membrana i bibuła są przycięte dokładnie do rozmiaru żelu i nie ma nawisów. Sprawdź wstępnie przycięte kanapki z membraną i bibułą filtracyjną

Poor Transfer of a Wide Range of Protein Sizes

.

Możliwe Cause	Remedycja
Różne warunki wymagane do transferu dużych i małych białek	Refer to "Transfer szerokiego zakresu MW białek może wymagać transferu wieloetapowego" (T. Otter et al., Anal. Biochem. 162:370-377 (1987). Użyj systemu trzech buforów do transferu półsuchego (Zobacz protokół na stronie 36 w Protein Blotting Handbook (PDF).)