Wytwarzanie przeciwciał: Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne

Przeciwciała są zwykle wytwarzane przez komórki B, które są częścią układu odpornościowego, w odpowiedzi na wprowadzenie obcych substancji, takich jak czynniki zakaźne, do organizmu zwierzęcia. Przeciwciała wiążą się z antygenami, które powodują ich wytwarzanie i oznaczają je do zniszczenia, pomagając w ten sposób zwalczyć infekcję. Ta wrodzona zdolność organizmu zwierzęcia może być wykorzystywana do generowania przeciwciał, które wiążą się z określonymi cząsteczkami.

Przeciwciała specyficzne dla celu mogą być wykorzystywane do izolowania i identyfikowania cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania. Przeciwciała stały się jednym z najważniejszych narzędzi w badaniach nauk przyrodniczych, umożliwiając wykrywanie, oznaczanie ilościowe i określanie zmian w białkach i innych cząsteczkach w odniesieniu do czasu i innych zaburzeń. 

Czytaj dalej, aby poznać różnice między przeciwciałami monoklonalnymi i poliklonalnymi, w tym różnice w sposobie generowania tych przeciwciał.

• Przeciwciała monoklonalne a poliklonalne
  
• Liczby klonów
• Formaty przeciwciał
• Biologiczne efekty przeciwciał
• Powiązane produkty

Przeciwciała monoklonalne a poliklonalne

Istnieje wiele różnic między przeciwciałami monoklonalnymi a poliklonalnymi, takich jak sposób ich wytwarzania. Wiele przeciwciał stosowanych w technikach immunochemicznych powstaje w wyniku wielokrotnej immunizacji odpowiedniego zwierzęcia, np. królika, kozy, osła lub owcy, odpowiednim antygenem. Surowica jest pobierana w szczytowym momencie produkcji przeciwciał. Za pomocą tej metody można uzyskać specyficzne stężenia IgG wynoszące około 1 do 10 mg/ml surowicy. Słabo antygenowe cząsteczki mogą wymagać dodania adiuwantu, który pozwala na powolne uwalnianie antygenu, dzięki czemu jest on łatwiej wychwytywany przez makrofagi. Mniejsze cząsteczki, takie jak leki, muszą być połączone z bardziej antygenowymi strukturami (tj. białkami nośnikowymi), aby stymulować odpowiedź immunologiczną.

Jedną z cech charakterystycznych dużych cząsteczek antygenów jest to, że indukują one aktywację wielu klonów komórek B wytwarzających przeciwciała u immunizowanego zwierzęcia. Ta poliklonalna mieszanina powstałych przeciwciał może następnie rozpoznawać różne epitopy na antygenie, co może być przydatną cechą w niektórych procedurach eksperymentalnych. Ponieważ te poliklonalne mieszaniny przeciwciał reagują z wieloma epitopami na powierzchni antygenu, będą one bardziej tolerancyjne na drobne zmiany w antygenie, np. polimorfizm, heterogeniczność glikozylacji lub niewielką denaturację, niż przeciwciała monoklonalne (homogenne). W zależności od antygenu, który jest używany do tworzenia przeciwciała, można użyć przeciwciał poliklonalnych do identyfikacji białek o wysokiej homologii do białka immunogennego lub do badania przesiewowego białka docelowego w próbkach tkanek z gatunków innych niż immunogen. Z tego samego powodu szczególnie ważne jest, aby podczas pracy z przeciwciałami poliklonalnymi dowiedzieć się jak najwięcej o immunogenie, który został użyty do produkcji przeciwciała poliklonalnego oraz o potencjale niepożądanej reaktywności krzyżowej w analizowanej próbce. Immunogeny peptydowe są często wykorzystywane do generowania przeciwciał poliklonalnych, które celują w unikalne epitopy, szczególnie w przypadku rodzin białek o wysokiej homologii.

Rysunek 1. Generowanie przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych Schemat przedstawiający produkcję przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych. Punktem wyjścia jest duży immunogen antygenowy, który daje przeciwciała poliklonalne o wielu epitopach. Strzałki biegną dwiema ścieżkami, jedna prowadzi do małego immunogenu peptydowego z mniejszą liczbą przeciwciał poliklonalnych o ograniczonym epitopie, podczas gdy druga prowadzi do punktu, który izoluje i łączy komórki B z linią hybrydoma i prowadzi badania przesiewowe. Kolejna strzałka prowadzi od małego immunogenu peptydowego do hybrydomy. Stamtąd strzałka prowadzi do innego punktu reprezentującego przeciwciało monoklonalne z jednym epitopem. Z boku znajduje się komórka z przeciwciałem, co oznacza, że każda komórka B wytwarza przeciwciała tylko dla jednego epitopu.

Jednorodna populacja przeciwciał (tj. przeciwciał monoklonalnych) może być hodowana poprzez fuzję limfocytów B z nieśmiertelnymi kulturami komórkowymi w celu wytworzenia hybrydom. Hybrydomy wytwarzają wiele kopii dokładnie tego samego przeciwciała. To imponujące zjawisko odegrało kluczową rolę w rozwoju przeciwciał do zastosowań diagnostycznych, ponieważ przeciwciała monoklonalne reagują z jednym epitopem na antygenie. Są one jednak bardziej podatne na utratę epitopu w wyniku chemicznej obróbki antygenu niż przeciwciała poliklonalne. Można to zrekompensować łącząc dwa lub więcej przeciwciał monoklonalnych z tym samym antygenem.

Właściwości przeciwciał poliklonalnych

• Przeciwciała poliklonalne często rozpoznają wiele epitopów, dzięki czemu są bardziej tolerancyjne na niewielkie zmiany w naturze antygenu. Przeciwciała poliklonalne są często preferowanym wyborem do wykrywania zdenaturowanych białek.
• Przeciwciała poliklonalne mogą być generowane u różnych gatunków, w tym królika, kozy, owcy, osła,
  kurczaka i innych, dając użytkownikom wiele opcji w projektowaniu eksperymentów.
• Przeciwciała poliklonalne są czasami stosowane, gdy natura antygenu u niesprawdzonego gatunku nie jest znana.
• Przeciwciała poliklonalne celują w wiele epitopów, dzięki czemu generalnie zapewniają bardziej niezawodne wykrywanie.

Właściwości przeciwciał monoklonalnych

• Z uwagi na swoją specyficzność, przeciwciała monoklonalne doskonale sprawdzają się jako podstawowe przeciwciało w teście lub do wykrywania antygenów w tkankach i często powodują znacznie mniejszy sygnał tła niż przeciwciała poliklonalne.
• W porównaniu do przeciwciał poliklonalnych, jednorodność przeciwciał monoklonalnych jest bardzo wysoka.
• Jeśli warunki eksperymentalne są utrzymywane na stałym poziomie, wyniki przeciwciał monoklonalnych będą wysoce powtarzalne między eksperymentami.
• Specyficzność przeciwciał monoklonalnych sprawia, że są one niezwykle skuteczne w wiązaniu antygenu w mieszaninie powiązanych cząsteczek, na przykład w przypadku oczyszczania metodą powinowactwa.

Zalety i wady przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych

	Zalety	Wady
Przeciwciała poliklonalne	Wady
Przeciwciała poliklonalne	Śmierć zwierzęcia może zakończyć źródło przeciwciał. Różne krwawienia mogą dawać różne wyniki. Immunizacja nowego zwierzęcia tym samym antygenem może prowadzić do powstania różnych epitopów i różnych klonów. Wspólne epitopy na różnych białkach mogą prowadzić do znakowania białek innych niż białko antygenu. Możliwa jest większa zmienność między partiami. Może wytwarzać niespecyficzne przeciwciała, które mogą zwiększać sygnał tła.	Stosunkowo łatwe do wygenerowania i bardziej opłacalne. Wiele epitopów na tym samym białku może generować wiele przeciwciał. W związku z tym dostarczają one silniejszych sygnałów. Przeciwciała poliklonalne mogą generować lepsze sygnały z białkami wyrażonymi w niskich poziomach. Są one kompatybilne z szerszym zakresem zastosowań. Przeciwciała poliklonalne zapewniają większą elastyczność w rozpoznawaniu antygenów. Na przykład mogą wiązać antygen pomimo polimorfizmu, heterogeniczności glikozylacji itp. Dzięki temu mogą identyfikować białka o wysokiej homologii lub pochodzące od różnych gatunków. Lepiej nadają się do wykrywania zdenaturowanych białek.
Przeciwciała monoklonalne	Różne klony przeciwciał mogą być generowane dla różnych epitopów na pojedynczym antygenie. Komórki hybrydoma mogą służyć jako nieskończone źródło tego samego przeciwciała. Wysoka specyficzność przeciwciał monoklonalnych minimalizuje tło i eliminuje reaktywność krzyżową. Ich jednorodność jest bardzo wysoka i zapewniają spójne, powtarzalne wyniki. Zmienność między partiami jest bardzo minimalna.	Produkcja przeciwciał monoklonalnych jest bardziej pracochłonna. Wymaga więcej pracy, zwłaszcza w procesie klonowania i selekcji. Mogą być ograniczone w swoich zastosowaniach. Znaczna większość przeciwciał monoklonalnych jest produkowana na myszach ze względu na solidną linię komórek szpiczaka. Wysoka specyficzność przeciwciał monoklonalnych ogranicza ich zastosowanie u wielu gatunków. Przeciwciała monoklonalne są bardziej podatne na utratę epitopu poprzez obróbkę chemiczną antygenu.

Numery klonów

Każdy numer klonu reprezentuje określoną linię komórkową, która została użyta do produkcji przeciwciała. Ponieważ przeciwciała są produkowane przez więcej niż jednego gospodarza, każda sklonowana linia komórkowa otrzymuje unikalny numer klonu. Każdy klon komórek hybrydoma wytwarza tylko jeden typ czystego przeciwciała.

• Zwierzę, któremu wstrzyknięto antygen, wytworzy wiele przeciwciał dla wielu epitopów. Ponieważ przeciwciała są wytwarzane przez komórki B, pojedynczy klon komórek B może wytwarzać przeciwciała tylko dla jednego epitopu.
• Przeciwciała monoklonalne pochodzą z pojedynczego klonu komórek i mogą być wytwarzane w większych ilościach.
• Przeciwciała poliklonalne zawierają wiele klonów przeciwciał wytwarzanych dla różnych epitopów na antygenie. Na przykład, jeśli na antygenie znajdują się cztery epitopy, wytworzone zostaną cztery różne klony przeciwciał.
• Różne klony przeciwciał mogą mieć różne właściwości, a nawet mogą mieć różne izotypy. Mogą również działać w różnych zastosowaniach. Dlatego najlepiej jest wybrać klon przeciwciała, który będzie działał optymalnie w wybranym zastosowaniu.
• Ważne jest, aby pamiętać, że numer klonu nie jest synonimem numeru partii, który często wskazuje datę produkcji.

Formaty przeciwciał

Jak sama nazwa wskazuje, format przeciwciała odnosi się do prezentacji lub stanu oczyszczenia przeciwciała. Poniżej opisano różne formaty:

Przeciwciała poliklonalne

Przeciwciała poliklonalne są często dostępne w stosunkowo nieoczyszczonych formatach i są określane jako "surowica odpornościowa" lub po prostu "surowica". Surowica odpornościowa odnosi się do krwi immunizowanego gospodarza, z której usunięto białka krzepnięcia i krwinki czerwone. Surowica odpornościowa, jak sama nazwa wskazuje, nadal zawiera przeciwciała/immunoglobuliny wszystkich klas, a także inne białka surowicy. Oprócz przeciwciał, które rozpoznają docelowy antygen, surowica odpornościowa zawiera również przeciwciała przeciwko różnym innym antygenom, które mogą czasami reagować niespecyficznie w testach immunologicznych. Z tego powodu surowicza surowica odpornościowa jest często poddawana etapom oczyszczania w celu wyeliminowania białek surowicy i wzbogacenia frakcji immunoglobuliny, która specyficznie reaguje z docelowym antygenem.

Surowica odpornościowa jest zwykle oczyszczana jedną z dwóch metod: Oczyszczanie białka A/G lub chromatografia powinowactwa do antygenu.

Oczyszczanie białka A/G wykorzystuje wysokie powinowactwo Staphylococcus aureus białka A lub Streptococcus białka G do domeny Fc immunoglobuliny. Podczas gdy oczyszczanie białka A/G eliminuje większość białek surowicy z surowicy odpornościowej, nie eliminuje niespecyficznej frakcji immunoglobulin. W rezultacie surowica odpornościowa oczyszczona z białka A/G może nadal wykazywać niepożądaną reaktywność krzyżową.

Oczyszczanie powinowactwa antygenu wykorzystuje powinowactwo specyficznej frakcji immunoglobulin do antygenu immunizującego, przeciwko któremu została wytworzona. Metoda ta może być stosowana do usuwania niepożądanych przeciwciał z preparatu. Preparat przeciwciał jest przepuszczany przez matrycę kolumnową zawierającą antygeny, przeciwko którym skierowane są niepożądane przeciwciała. Niepożądane przeciwciała pozostają związane z kolumną, a ścieki zawierają pożądane, oczyszczone przez powinowactwo przeciwciała. Alternatywnie można użyć matrycy kolumny połączonej z pożądanym antygenem. W tym przypadku przeciwciało skierowane przeciwko sprzężonemu antygenowi pozostaje związane z kolumną i może być następnie wymywane za pomocą roztworu, który przerywa wiązanie antygen-przeciwciało. W przeciwieństwie do oczyszczania białka A / G, oczyszczanie powinowactwa antygenu powoduje eliminację większości niespecyficznej frakcji immunoglobulin, jednocześnie wzbogacając frakcję immunoglobulin, która specyficznie reaguje z docelowym antygenem. Uzyskana w ten sposób immunoglobulina oczyszczona metodą powinowactwa będzie zawierać przede wszystkim immunoglobulinę o pożądanej swoistości.

Zwykle przeciwciała oczyszczone metodą powinowactwa wykazują niższe tło niż przeciwciała niewchłonięte, a ten proces oczyszczania jest szczególnie ważny w przypadku trudnych lub zależnych od stanu epitopów. Podczas opracowywania przeciwciał poliklonalnych, które rozpoznają cele z modyfikacjami potranslacyjnymi, zastosowanie kolumn powinowactwa antygenowego specyficznych dla modyfikacji podczas procesu oczyszczania może znacznie poprawić swoistość przeciwciała dla celu zależnego od stanu. Usunięcie niezmodyfikowanego białka docelowego z surowicy przed oczyszczaniem powinowactwa (przy użyciu unieruchomionego, zmodyfikowanego białka docelowego) zwiększa swoistość dla zmodyfikowanego celu. Testy swoistości można następnie przeprowadzić w celu potwierdzenia, że przeciwciało rozpoznaje tylko potranslacyjnie zmodyfikowaną formę białka.

Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne mogą być hodowane w hodowlach komórkowych i zbierane jako supernatanty hybrydoma lub hodowane u myszy lub szczurów i zbierane jako względnie nieoczyszczony płyn puchlinowy. Mogą one być oczyszczane poprzez zastosowanie chromatografii powinowactwa białka A/G lub specyficznego antygenu, tak jak w przypadku przeciwciał poliklonalnych. Jeśli specyficzne stężenie przeciwciał danego nieoczyszczonego preparatu przeciwciał jest nieznane, można odnieść się do następujących "typowych zakresów" jako wytycznych do oszacowania:

• Polyclonal Antiserum: Specyficzne stężenia przeciwciał będą zazwyczaj wynosić od 1-3 mg/ml.
• Supernatant z hybrydomy: Specyficzne stężenia przeciwciał będą zazwyczaj wynosić od 0,1-10,0 mg/ml.
• Płyn z akcyzy (nieoczyszczony): Specyficzne stężenia przeciwciał zazwyczaj mieszczą się w zakresie 2-10 mg/ml.

Dowiedz się więcej o innym formacie przeciwciał, rekombinowanych przeciwciałach, które są wysoce powtarzalne w naszym artykule technicznym na ZooMAb^® rekombinowane przeciwciała monoklonalne.

Biologiczne działanie przeciwciał

Przeciwciała są szeroko stosowane do ochrony przed czynnikami zakaźnymi. Większość szczepionek (antygenów drobnoustrojów) indukuje produkcję przeciwciał, które blokują infekcję lub zakłócają inwazję drobnoustrojów do krwiobiegu. Aby to osiągnąć, przeciwciała muszą być funkcjonalne w tym sensie, że są zdolne do neutralizacji lub opsonofagocytozy.

Cytoliza kompleksu atakującego błonę (MAC) MAC powstaje na powierzchni patogennej komórki bakteryjnej w wyniku aktywacji układu dopełniacza (zarówno alternatywnego, jak i klasycznego). MAC tworzy kanały transmembranowe w ścianach bakterii, zakłócając ich dwuwarstwę fosfolipidową i prowadząc do lizy i śmierci komórki.

Neutralizacja wirusów

Przeciwciała mogą zakłócać wiązanie wirionów z receptorami i blokować ich wchłanianie do komórek. Wiele wirusów otoczkowych ulega lizie, gdy przeciwciała przeciwwirusowe i układ dopełniacza rozbijają błony. Niektóre przeciwciała mogą również agregować cząsteczki wirusa. Przeciwciała nieneutralizujące są również wytwarzane po każdej infekcji wirusowej. Chociaż przeciwciała te wiążą się specyficznie z cząsteczkami wirusa, nie neutralizują ich. Wręcz przeciwnie, mogą zwiększać zakaźność, ponieważ kompleks wirus-przeciwciało dostaje się do komórki poprzez endocytozę. Może to prowadzić do replikacji wirusa. Rodzaj wytwarzanego przeciwciała może wpływać na wynik infekcji wirusowej. Na przykład wirus polio może wywoływać odpowiedzi IgM i IgG we krwi, ale śluzówkowa IgA jest niezbędna do zablokowania infekcji. IgA neutralizuje wirusa polio w jelicie, miejscu pierwotnej infekcji. W związku z tym żywa atenuowana szczepionka Sabina przeciwko wirusowi polio jest bardziej skuteczna, ponieważ wywołuje silną odpowiedź śluzówkową IgA.

Immobilizacja

Przeciwciało może być skierowane przeciwko rzęskom lub wiciom ruchliwych bakterii lub pierwotniaków, co powoduje zatrzymanie ich ruchliwości i blokuje ich zdolność do poruszania się i rozprzestrzeniania infekcji.

Kytoliza

Niektóre przeciwciała mogą powodować przerwanie błony komórkowej drobnoustrojów, co skutkuje śmiercią komórek bakteryjnych. Wymaga to udziału układu dopełniacza.

Opsonizacja

W tym procesie patogenny organizm jest namierzany do strawienia przez fagocyty. Przeciwciało wiąże się z receptorem na błonie komórkowej bakterii, przyciągając fagocyty do tego miejsca. Część F(ab) przeciwciała wiąże się z antygenem, podczas gdy część Fc przeciwciała wiąże się z receptorem Fc na fagocytach, ułatwiając fagocytozę. Proces ten jest dodatkowo wzmacniany przez układ dopełniacza.

Neutralizacja egzotoksyn

Przeciwciała antytoksynowe mogą być generowane przeciwko toksynom mikrobiologicznym. Region F(ab) przeciwciała wytworzonego przeciwko epitopowi miejsca wiązania egzotoksyny może blokować wiązanie egzotoksyny z receptorem egzotoksyny na błonie komórkowej gospodarza. Blokuje to wejście toksyny do komórki.

Zapobieganie adhezji bakterii do komórek gospodarza

Wrodzone mechanizmy obronne organizmu mogą fizycznie usuwać bakterie poprzez ciągłe zrzucanie komórek nabłonka powierzchniowego ze skóry i błon śluzowych. Jednak bakterie mogą się temu oprzeć, wytwarzając pili, białka adhezyjne ściany komórkowej i kapsułki wytwarzające biofilm. Region F(ab) przeciwciała może wiązać się z adhezyjną końcówką pili, adhezynami ściany komórkowej lub cząsteczkami otoczki i blokować adhezję bakterii do komórek gospodarza.

Aglutynacja mikroorganizmów

Miejsca F(ab) przeciwciał IgM i IgA mogą łączyć ze sobą mikroorganizmy i powodować ich aglutynację. Aglutynowane mikroorganizmy mogą być skuteczniej fagocytowane.