Metody stosowane do wykrywania białek i kwasów nukleinowych związanych z membranami

Do wizualizacji kwasów nukleinowych i specyficznych białek przeniesionych na nośnik membranowy stosuje się różne metody wykrywania. Southern i northern blotting wymagają użycia radioaktywnych sond, a detekcja obejmuje ekspozycję na promieniowanie rentgenowskie lub film autoradiograficzny w ciemności. W Western blotting, białka na membranie nitrocelulozowej mogą być wykrywane przy użyciu kolorymetrii, chemiluminescencji lub technik fluorescencyjnych.

Metody detekcji Western Blotting

Detekcja kolorymetryczna

Zasada: Powszechnie stosowane metody detekcji obejmują użycie przeciwciała pierwotnego specyficznego dla białka, a następnie detekcję przy użyciu przeciwciał wtórnych skoniugowanych z enzymem HRP (peroksydaza chrzanowa) lub AP (fosfataza alkaliczna). Po dodaniu substratu chromogennego enzym katalizuje reakcję i wytwarza barwny osad, który osadza się na blot. Osad ten jest łatwo widoczny i można go sfotografować.

Rysunek 1. Kolorymetryczne wykrywanie białek na membranie

System peroksydazy chrzanowej (HRP): Substraty kompatybilne z HRP to 4-chloro-1-naftol (4-CN; C8302), 3, 3'-diaminobenzydyna (DAB; D5905) i 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyna  (TMB; T0565).

W obecności nadtlenku wodoru, HRP sprzężone z przeciwciałem drugorzędowym

• utlenia 4-CN do niebiesko-fioletowego osadu 4-chloro-1-naftonu
• polimeryzuje DAB do DAB.li>polimeryzuje DAB do złożonego brązowego osadu
• utlenia TMB do ciemnoniebieskiego osadu diiminy TMB

System fosfatazy alkalicznej (AP): Substratem kompatybilnym z AP jest kombinacja fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolilu (BCIP^®) i nitroblue tetrazolium (NBT)  (nitroblue tetrazolium (NBT)).nbsp;(B5655, B6404, B6777, B1911)

Wizualizacja białka na western blot przy użyciu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z AP obejmuje kulminację dwuetapowej reakcji z fosforanem 5-bromo-4-chloro-3-indolilu (BCIP) i nitroblue tetrazolium (NBT). AP katalizuje tworzenie bromochloro-indoksylowego intermediatu poprzez defosforylację. NBT utlenia indoksyl, tworząc fioletowy osad, który z kolei jest redukowany do nierozpuszczalnego, niebieskiego osadu diformazanu. Połączenie tych dwóch osadów powoduje powstanie widocznego fioletowo-niebieskiego osadu na blot w miejscu, w którym znajduje się interesujące nas białko.

Rysunek 2. Struktury metod wykrywania

Detekcja chemiluminescencji

Zasada: Chemiluminescencja to proces, w którym reakcja chemiczna z udziałem substancji powoduje uwolnienie energii w postaci światła. Emitowane światło może być przechwycone na filmie rentgenowskim. Ta najczęściej stosowana metoda wykrywania obejmuje wykrywanie przy użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP (peroksydaza chrzanowa) lub AP (fosfataza alkaliczna).

Rysunek 3. Chemiluminescencyjna detekcja białek na membranie

System peroksydazy chrzanowej i luminolu: Luminol jest chemiluminescencyjnym substratem HRP. W obecności nadtlenku HRP utlenia luminol do wzbudzonego produktu zwanego 3-aminoftalanem, który emituje światło przy 425 nm. Emisja trwa do momentu rozpadu 3-aminoftalanu i przejścia do stanu podstawowego. Emitowane światło może być przechwycone przez kamerę CCD lub przez ekspozycję na film rentgenowski.

Fosfataza alkaliczna (AP) - system CDP-Star®: CDP-Star^® (2-chloro-5-(4-metoksyspiro{1,2-dioksetan-3,2'-(5'-chloro)triklo[3.3.1.1^3,7]dekan}-4-ylo)-1-fenylofosforan) jest chemiluminescencyjnym substratem AP. CDP-Star^® jest defosforylowany przez AP, dając metastabilny anion dioksetanofenolanowy, który emituje światło przy 466 nm. Emitowane światło jest stabilne do 24 godzin, co pozwala na wielokrotne naświetlanie filmów rentgenowskich.

Oferujemy szereg przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z enzymami HRP i AP. Te przeciwciała drugorzędowe mogą być stosowane z następującymi odczynnikami do wykrywania w Western blotting.

Detekcja fluorescencyjna

Zasada: Białko będące przedmiotem zainteresowania na Western blot można również wykryć przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi. Barwniki fluoryzują przy określonej długości fali i mogą być wykrywane poprzez obrazowanie blotu.

Rysunek 4. Fluorescencyjna detekcja białek na membranie

Oferujemy szereg przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z różnymi barwnikami fluorescencyjnymi Atto. Najlepiej nadają się one do multipleksowego immunoblottingu, w którym dwa przeciwciała drugorzędowe sprzężone z barwnikami Atto wykorzystują różne długości fali wzbudzenia/emisji. Multipleksowanie z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikami Atto jest najbardziej odpowiednie do wykrywania określonego białka w stanie fosforylowanym i niefosforylowanym.

Aby uzyskać więcej informacji na temat multipleksowego immunoblottingu, kliknij tutaj.

Metody wykrywania metodą Southern i Northern blotting

Southern i Northern blotting wymagają użycia radioaktywnych sond, a wykrywanie polega na ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie lub film autoradiograficzny w ciemności. Istnieją jednak substraty chemiluminescencyjne, które mogą być stosowane do wykrywania kwasów nukleinowych przeniesionych na membranę nylonową.

Detekcja chemiluminescencyjna

Do chemiluminescencyjnej detekcji sond kwasów nukleinowych konieczne jest inkubowanie membrany w buforze blokującym (B6429, C7594, G7663) przez 60 minut.

System HRP-Luminol: Reakcja pomiędzy HRP i luminolem może być również stosowana do wykrywania kwasów nukleinowych w Southern i Northern blotting. Sondy DNA i RNA mogą być znakowane HRP w prostej reakcji znakowania. Znakowana sonda może być używana bez dalszego oczyszczania. Sonda może być wykryta na blotcie przez reakcję generującą światło pomiędzy HRP i luminolem.

CDP-Star^® system: Sondy DNA i RNA mogą być znakowane CDP-Star^® termostabilną fosfatazą alkaliczną w prostej reakcji znakowania. Znakowana sonda może być używana bez dalszego oczyszczania. Surowość hybrydyzacji może być kontrolowana przez temperaturę, jak również stężenie soli.

Oferujemy następujące odczynniki do detekcji chemiluminescencyjnej dla Southern i Northern blotting.

Filmy rentgenowskie do detekcji

Oferujemy szeroką gamę filmów rentgenowskich do chemiluminescencyjnej detekcji białek na Western blot. Są one dostępne w różnych wygodnych rozmiarach opakowań. Najpopularniejsze rozmiary opakowań filmów Carestream Kodak Biomax są wymienione poniżej.

Wykrywanie radioaktywnej sondy w Southern i Northern blotting polega na ekspozycji sondy na filmie rentgenowskim w temperaturze -80 °C. Do wykrywania Southern i Northern blot oferujemy następujące filmy rentgenowskie w różnych wygodnych rozmiarach opakowań. Najpopularniejsze rozmiary opakowań filmów Carestream Kodak Biomax są wymienione poniżej.

Protokoły detekcji białek i kwasów nukleinowych

Chromogeniczna detekcja białek

Detekcja przy użyciu roztworu 4-CN:

• Po zakończeniu Western blot należy inkubować blot w buforze blokującym i przeciwciałem pierwotnym.
  
• Inkubować blot z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP lub AP.
  
• Czas inkubacji zależy od białka będącego przedmiotem zainteresowania i stężenia użytych przeciwciał.
  
• Umieść blot na czystej, płaskiej powierzchni.
  
• Przygotować roztwór substratu łącząc 4-CN i nadtlenek wodoru tak, aby końcowe stężenie nadtlenku wynosiło 0,01%.
  
• Pokryć równomiernie całą powierzchnię blot roztworem substratu w temperaturze pokojowej przez 1-5 minut.
  
• Po uzyskaniu pożądanej intensywności koloru, zatrzymać reakcję przemywając blot wodą.
  
• Obejrzeć obraz blotu.

Detekcja przy użyciu DAB:

• Po zakończeniu Western blot, inkubować blot w buforze blokującym i przeciwciałem pierwotnym.
• Ikubuj blot z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP lub AP.
• Czas inkubacji zależy od białka będącego przedmiotem zainteresowania i stężenia użytych przeciwciał.
• Umieść blot na czystej, płaskiej powierzchni.
• Przygotuj roztwór substratu rozpuszczając jedną tabletkę DAB w 15 ml zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej, pH 7,6. Dodaj 12 µl świeżego 30% nadtlenku wodoru tuż przed użyciem. Stężenia DAB i nadtlenku mogą być zmieniane w zależności od potrzeb.
• Pokryj równomiernie całą powierzchnię kleksa roztworem substratu w temperaturze pokojowej przez 1-5 min.
• Po uzyskaniu pożądanej intensywności koloru, zatrzymaj reakcję przemywając kleks wodą.
• Obejrzyj obraz blotu.

Detekcja przy użyciu TMB:

• Po zakończeniu Western blot, inkubuj blot w buforze blokującym i przeciwciałem pierwotnym.
• Inkubacja blotu z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP lub AP.
• Czas inkubacji zależy od białka będącego przedmiotem zainteresowania i stężenia użytych przeciwciał.
• Umieść blot na czystej, płaskiej powierzchni.
• Pokryj równomiernie całą powierzchnię blotu roztworem TMB w temperaturze pokojowej przez 5-15 minut.
• Po uzyskaniu pożądanej intensywności koloru, zatrzymaj reakcję przemywając blot wodą o wysokiej czystości.
• Uzyskaj obraz blotu.

Detekcja przy użyciu BCIP^®/NBT:

• Po zakończeniu Western blot należy inkubować blot w buforze blokującym i przeciwciałem pierwotnym.
• Ikubuj blot z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP lub AP.
• Czas inkubacji zależy od białka będącego przedmiotem zainteresowania i stężenia użytych przeciwciał.
• Umieść blot na czystej, płaskiej powierzchni.
• Pokryj równomiernie całą powierzchnię blota roztworem BCIP^®/NBT w temperaturze pokojowej przez 1-5 minut.
• Po uzyskaniu pożądanej intensywności koloru, zatrzymaj reakcję przemywając blot wodą lub 1% roztworem kwasu octowego.
• Obejrzyj obraz blotu.

Chemiluminescence Detection of Proteins

• Po zakończeniu Western blot, inkubuj blot w buforze blokującym i pierwotnym przeciwciałem.
• Inkubacja blotu z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym HRP lub AP.
• Czas inkubacji zależy od białka będącego przedmiotem zainteresowania i stężenia użytych przeciwciał.
• Umieść blot na czystej, płaskiej powierzchni.
• Przygotuj odczynnik do chemiluminescencji mieszając równe objętości odczynnika luminolu i utleniacza w zlewce. Wlać tę mieszaninę na kleks i inkubować przez około 1 minutę z delikatnym wstrząsaniem.
• Usuń nadmiar odczynnika chemiluminescencyjnego, przecierając kleks na bibule.
• Przenieś kleks do ciemnego pomieszczenia.
• Umieść kleks między dwiema warstwami folii w kasecie foliowej. Wygładzić ewentualne pęcherzyki powietrza.
• Umieścić folię rentgenowską na górze plamy, naświetlać przez około 30 sekund i wywołać.
• Zmienić czas ekspozycji zgodnie z wymaganiami dla optymalnego wykrywania.

Chemiluminescencyjne wykrywanie kwasów nukleinowych

Powyższy protokół może być również stosowany, jeśli odczynniki chemiluminescencyjne są używane do wykrywania kwasów nukleinowych na Southern i Northern blotach.

Referencje

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.