Uniwersalny protokół SYBR Green qPCR
Technology Overview
Assay Considerations
Methods of Quantification
Equipment & Supplies
PCR Mix Selection Guide
Protocol
Troubleshooting
Materials
Referencje
Przegląd technologii: SYBR Green qPCR
Dzięki rozwojowi termocyklerów z detekcją fluorescencyjną, PCR zyskał nowe, innowacyjne zastosowanie. W rutynowym PCR, krytycznym wynikiem jest ostateczna ilość amplikonu wygenerowanego po procesie. PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowy oraz RT-PCR wykorzystują liniowość amplifikacji DNA do określenia bezwzględnej lub względnej ilości znanej sekwencji w próbce. Dzięki zastosowaniu fluorescencyjnego reportera w reakcji, możliwe jest zmierzenie wytwarzania DNA.
Rysunek 1.Przegląd technologii: SYBR Green qPCR
W ilościowym PCR amplifikacja DNA jest monitorowana w każdym cyklu PCR. Gdy DNA znajduje się w logarytmicznej fazie liniowej amplifikacji, ilość fluorescencji wzrasta powyżej tła. Punkt, w którym fluorescencja staje się mierzalna, nazywany jest cyklem kwantyfikacji (Cq) lub punktem przejścia. Stosując wielokrotne rozcieńczenia znanej ilości standardowego DNA, można wygenerować krzywą standardową stężenia logarytmicznego względem Cq. Ilość DNA lub cDNA w nieznanej próbce można następnie obliczyć na podstawie wartości Cq .
A) Różne fazy reakcji:
Podstawowa: Początkowe stężenie matrycy jest niskie; dlatego intensywność fluorescencji jest zbyt niska, aby można ją było wykryć i widoczny jest tylko sygnał tła.
Eksponencjalny: Po osiągnięciu przez docelową wydajność progu detekcji, pokazanego jako czerwona linia progowa, przebieg reakcji można śledzić w fazie wykładniczej.
Liniowa: Wraz ze wzrostem stężenia matrycy, dostępne stężenie polimerazy DNA zmniejsza się, a szybkość reakcji maleje.
Plateau: Nie ma wystarczającej ilości wolnego enzymu, aby kontynuować amplifikację, więc po tym punkcie reakcja osiąga maksymalną wydajność lub fazę plateau.
B) Poszczególne reakcje charakteryzują się cyklem, w którym fluorescencja po raz pierwszy wzrasta powyżej progu, co jest określane jako cykl kwantyfikacji (Cq). Jeśli materiał wyjściowy jest obfity, amplifikację obserwuje się we wcześniejszych cyklach, a wartość Cq jest niższa. Jeśli materiału wyjściowego jest mało, amplifikację obserwuje się w późniejszych cyklach, a Cq jest wyższe. Ta korelacja między fluorescencją, Cq i ilością amplifikowanego produktu umożliwia kwantyfikację matrycy w szerokim zakresie dynamicznym.
Real time PCR nadaje się również do badań względnych. Reakcję można przeprowadzić przy użyciu starterów unikalnych dla każdego regionu, który ma być amplifikowany i znakowany różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Kilka dostępnych na rynku ilościowych termocyklerów zawiera wiele kanałów detekcji. W tym systemie multipleksowym ilość docelowego DNA/cDNA można porównać z ilością sekwencji podtrzymującej, np. GAPDH lub β-aktyny.
NR= niezalecane
X= zalecane
XX= preferowana metoda
Uwagi dotyczące testu.
Przygotowanie DNA
Najważniejszym krokiem zapewniającym sukces w PCR jest wysokiej jakości przygotowanie DNA. Niezbędna jest integralność i czystość matrycy DNA. Ilościowy PCR obejmuje wiele rund reakcji enzymatycznych i dlatego jest bardziej wrażliwy na zanieczyszczenia, takie jak białka, fenol/chloroform, sole, EDTA i inne rozpuszczalniki chemiczne. Zanieczyszczenia mogą również zakłócać wykrywanie fluorescencji. Stosunek wartości absorbancji przy 260 nM i 280 nM pozwala oszacować czystość DNA. Czyste DNA ma stosunek A260/A280 wynoszący 1,8-2,0. Niższe stosunki wskazują na obecność zanieczyszczeń, takich jak białka.
Szablon
Do zainicjowania qPCR potrzeba bardzo niewielu kopii docelowego kwasu nukleinowego (co odpowiada około 100 pg gDNA lub cDNA). Aby zminimalizować zanieczyszczenie inhibitorami reakcji, początkowa ilość matrycy powinna być ograniczona do minimum wymaganego do uzyskania dokładnej kwantyfikacji. Gdy materiałem wyjściowym jest RNA, projektowanie starterów i traktowanie DNazą I zmniejszy sygnały, które mogą być generowane przez zanieczyszczenie gDNA.
Projektowanie starterów
Niezależnie od tego, czy używany jest barwnik wiążący dsDNA, czy chemia detekcji oparta na sondach, projektowanie wysokiej jakości starterów jest jednym z najważniejszych etapów przedeksperymentalnych w qPCR. Specyficzne startery do PCR powinny być projektowane za pomocą oprogramowania do projektowania starterów, aby wyeliminować komplikacje związane z primer-dimerami i strukturami drugorzędowymi. Niższe stężenia primerów zmniejszają akumulację tworzenia primerów-dimerów i niespecyficznego tworzenia produktu, co ma kluczowe znaczenie przy stosowaniu barwnika SYBR Green I w ilościowym PCR.
dNTPs
Standardowe mastermiksy PCR/qPCR zawierają dATP, dCTP, dGTP i dTTP. Dostępne są jednak pewne mieszanki, które zastępują dTTP dUTP. Produkty z poprzednich reakcji przeprowadzonych z dUTP będą zawierać uracyl zamiast tyminy. Są one następnie podatne na rozszczepienie przez glikozylazę Uracil-DNA (UNG). Dlatego wcześniejsza inkubacja kolejnych reakcji z UNG zapobiega przenoszeniu zanieczyszczeń między reakcjami.
Stężenie magnezu
Chlorek magnezu (MgCl2) jest niezbędny dla aktywności odwrotnej transkryptazy, polimerazy Taq DNA i egzonukleazy Taq DNA 5' do 3'. Optymalne stężenia Mg2+ dla reakcji zawierających DLP wynoszą zwykle od 3 do 6 mM. Niższe stężenia chlorku magnezu zwykle powodują powstawanie mniejszej ilości niespecyficznych produktów. Niektóre roztwory ReadyMix są dostarczane w stężeniu 2X 7 mM chlorku magnezu (stężenie końcowe 3,5 mM). W niektórych przypadkach dostarczana jest fiolka z 25 mM roztworem chlorku magnezu w celu dalszej optymalizacji końcowego stężenia chlorku magnezu, jeśli to konieczne. Mieszanina reakcyjna, która nie zawiera MgCl2 może być czasami wymagana, aby można było użyć niskiego stężenia, np. podczas wykrywania za pomocą sondy Scorpion.
Odwrotna transkryptaza
Enzym odwrotnej transkryptazy, który zapewnia wysoką wydajność cDNA, zachowując aktywność w wysokiej temperaturze, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia RT-qPCR. Wydajność w wysokich temperaturach pomaga zapewnić, że regiony RNA o znaczącej strukturze drugorzędowej są destabilizowane i dostępne do hybrydyzacji i późniejszej amplifikacji. Podczas wykonywania jednoetapowego RT-qPCR, wysoka temperatura pozwala na stosowanie starterów specyficznych dla genów o wysokich temperaturach topnienia (Tm), co zwiększa specyficzność reakcji. Podczas wykonywania protokołów dwuetapowych ważne jest, aby zapewnić, że enzym daje liniową i proporcjonalną wydajność cDNA z RNA. Minimalizacja pipetowania może zmniejszyć zmienność. Niektóre zestawy ReadyMix zawierają startery i inne odczynniki potrzebne do przeprowadzenia RT, na przykład ReadyScript® cDNA Synthesis Mix (RDRT).
Taq DNA Polymerase
Podobnie jak w przypadku wyboru najbardziej odpowiedniej odwrotnej transkryptazy do RT, wybór odpowiedniego enzymu jest kluczowy. Podstawowym problemem związanym z naturalną polimerazą Taq DNA jest to, że enzym ten wykazuje szczątkową aktywność w niskiej temperaturze. Niespecyficzne wiązanie starterów prowadzi do niespecyficznego tworzenia produktu w wyniku tej resztkowej aktywności polimerazy. Zablokowane przeciwciałami lub chemicznie polimerazy Taq DNA ("hot-start") pomagają naprawić tę sytuację, zapobiegając aktywności enzymu do momentu rozpoczęcia etapu denaturacji w wysokiej temperaturze.
Wewnętrzny barwnik referencyjny według typu urządzenia
Niektóre termocyklery PCR w czasie rzeczywistym wymagają barwnika ładującego, takiego jak ROX, aby kontrolować zmienność systemu optycznego i normalizować różnice w intensywności sygnału. Podobnie, niektóre termocyklery wymagają fluoresceiny, aby stworzyć wirtualne tło podczas pracy z testami barwnika SYBR Green I (które mają bardzo niskie tło). Mogą one być dostarczane w ReadyMix lub jako oddzielne składniki, dzięki czemu można użyć odpowiedniego stężenia. W niektórych przypadkach do normalizacji reakcji dołączona jest fiolka z wewnętrznym barwnikiem referencyjnym. Maksymalne wzbudzenie tego barwnika wynosi 586 nM, a maksymalna emisja 605 nM. Standardowe ustawienia przyrządu dla barwnika referencyjnego ROX są zadowalające dla pomiaru wewnętrznego barwnika referencyjnego. Ten wewnętrzny barwnik referencyjny jest niezbędny dla systemów ABI Sequence Detection Systems.
Instrumenty
Należy wybrać odczynniki kompatybilne z instrumentami. Platformy wykorzystują różne barwniki normalizujące, dlatego należy wybrać odczynniki z kompatybilnymi barwnikami normalizującymi (patrz Appendix 1).
Wiele urządzeń qPCR zostało zaprojektowanych do obsługi określonego zakresu zastosowań, np. w przeciwieństwie do ABI 7900 o wysokiej przepustowości z automatycznym ładowaniem płytek 384-dołkowych z urządzeniem Illumina Eco, które obsługuje pojedynczą płytkę 48-dołkową. Najbardziej odpowiedni instrument spełnia potrzeby badań. Pożądane jest wybranie urządzenia z przyjaznym dla użytkownika oprogramowaniem, które wykonuje najbardziej pożądane funkcje i jest elastyczne pod względem danych wyjściowych, dzięki czemu można nimi łatwo manipulować w dalszych pakietach oprogramowania do analizy statystycznej. Skraca to czas wymagany do przeszkolenia personelu, a tym samym do rozpoczęcia generowania wyników. Dodatkowe wymagane cechy obejmują blok PCR, który jest absolutnie jednolity (bezwzględne maksymalne odchylenie 1Cq = 2 razy w 96 dołkach replikacji) oraz system optyczny, który wzbudza i wykrywa emisję tak czule i równomiernie, jak to możliwe w szerokim zakresie długości fal. Pozwala to na szeroki wybór fluoroforów i umożliwia multipleksowanie. Inne cechy, które należy wziąć pod uwagę, to koszty operacyjne związane z określonymi materiałami eksploatacyjnymi, np. jeśli standardowa płytka mikromiareczkowa nie jest używana do reakcji, a także wygoda ładowania płytek / probówek o niestandardowym formacie.
Kontrole
Kontrola pozytywna jest zawsze pomocna, aby upewnić się, że wszystkie składniki zestawu działają prawidłowo. Kontrola bez szablonu/negatywna jest niezbędna do określenia, czy obecne jest zanieczyszczenie. Sygnał w kontroli bez matrycy wskazuje na obecność zanieczyszczenia DNA lub tworzenie dimerów starterów.
Bufor
Bufory lub mastromiksy reakcyjne zazwyczaj zawierają dNTP, polimerazę Taq DNA, MgCl2 i stabilizatory. SYBR Green I, ROX™, fluoresceina i obojętne barwniki ładujące mogą być również zawarte, w zależności od chemii wykrywania, instrumentu i wymagań reakcji. Składniki buforu PCR i stabilizatory są zazwyczaj własnością producenta. W przypadku zakupu oddzielnie, możliwa jest maksymalna elastyczność, ponieważ każdy składnik może być indywidualnie zoptymalizowany w reakcji. Jednak w przeciwieństwie do tego, zakup składników razem jako mastermix zmniejsza elastyczność, zwiększa spójność partii i wygodę, jednocześnie zmniejszając liczbę etapów pipetowania, a tym samym ryzyko błędu i zanieczyszczenia.
Analiza danych
Postępuj zgodnie z zaleceniami urządzenia czasu rzeczywistego używanego do wykonywania ilościowego SYBR Green PCR. Poniższe informacje mogą pomóc nowym użytkownikom urządzeń. Ogólnie liczba cykli jest wykreślana w stosunku do fluorescencji. Cykle progowe (CTs) lub punkty przecięcia są używane do określenia ilości matrycy w każdej próbce. Cykl progowy lub punkt przecięcia to pierwszy cykl, który wykazuje wykrywalny wzrost fluorescencji z powodu tworzenia produktów PCR. Cykle przed punktem przecięcia są cyklami podstawowymi. Cykle podstawowe nie wykazują wykrywalnego wzrostu fluorescencji spowodowanego produktami PCR. Próg używany do określenia momentu wystąpienia pierwszego wykrywalnego wzrostu fluorescencji można również dostosować ręcznie. Próg powinien być zawsze ustawiany na logarytmicznym wykresie amplifikacji. W logarytmicznym wykresie amplifikacji próg powinien być ustawiony w zakresie logarytmiczno-liniowym, a nie w fazie plateau.
Krzywe topnienia
Wykonanie analizy krzywej topnienia na końcu przebiegu pomoże przeanalizować tylko interesujący produkt PCR. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia czasu rzeczywistego dotyczącymi analizy krzywej topnienia. Kolejne przebiegi z tymi samymi starterami można zmodyfikować, aby usunąć udział tworzenia dimeru startera w sygnale produktu poprzez zbieranie danych w dodatkowym etapie cyklu, którego temperatura musi leżeć pomiędzy już określonymi temperaturami topnienia dimeru i produktu (TMs).
.Metody kwantyfikacji
Krzywe standardowe
Krzywe standardowe są niezbędne zarówno do kwantyfikacji bezwzględnej, jak i względnej. Podczas generowania krzywych standardowych należy użyć różnych stężeń DNA (zazwyczaj pięciu) w celu wygenerowania krzywej standardowej, która będzie odpowiadać stężeniu nieznanego. Każde stężenie powinno być wykonane w duplikacie.
Kwantyfikacja bezwzględna i względna
Ten zestaw SYBR Green PCR może być używany do kwantyfikacji docelowego DNA przy użyciu kwantyfikacji bezwzględnej lub względnej. Techniki kwantyfikacji bezwzględnej są stosowane do określenia ilości docelowego DNA w próbce początkowej, podczas gdy kwantyfikacja względna określa stosunek między ilością docelowego DNA a amplikonem referencyjnym. Idealny amplikon referencyjny miałby niezmienną, konstytutywną ekspresję. W praktyce do tej funkcji wybierany jest gen gospodarza, ale istnieją inne wybory referencyjne, które lepiej spełniają powyższe wymagania.1
Absolutna kwantyfikacja wykorzystuje zewnętrzne standardy do określenia bezwzględnej ilości docelowego kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania. Aby usunąć różnice w kwantyfikacji spowodowane wyżarzaniem, miejsca wiązania starterów w zewnętrznych standardach muszą być takie same jak te w sekwencji docelowej. Idealny standard zewnętrzny zawiera sekwencje, które są takie same jak sekwencja docelowa lub które różnią się tylko nieznacznie od sekwencji docelowej. Równoważne wydajności amplifikacji między sekwencją docelową a wzorcem zewnętrznym są niezbędne do bezwzględnej kwantyfikacji. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu lub amplikonu, generowana jest krzywa standardowa rozcieńczeń wzorca zewnętrznego i wykorzystywana do określenia stężeń nieznanych próbek docelowych.
Względna kwantyfikacja umożliwia obliczenie stosunku między ilością szablonu docelowego a szablonem referencyjnym w próbce. Ponieważ metoda ta mierzy ilość celu w stosunku do przypuszczalnie niezmiennej kontroli, względna qPCR jest najczęściej stosowana do pomiaru różnic w polimorfizmie genetycznym, na przykład między tkankami lub między próbkami zdrowymi i chorymi. Zaletą tej techniki jest to, że użycie standardu wewnętrznego może zminimalizować różnice w przygotowaniu i obsłudze próbek. Podczas korzystania z systemów SYBR, kwantyfikacja celu i wewnętrznego wzorca musi być przeprowadzona w oddzielnych reakcjach.
Dokładność względnej kwantyfikacji zależy od właściwego wyboru wzorca odniesienia dla standardów. Zmienność standardu wpłynie na wyniki, dlatego najważniejsze jest, aby standardy były odpowiednie.1 Niektórzy badacze decydują się nie uruchamiać krzywej standardowej i zgłaszać ilości docelowe jako ułamek odniesienia, technika określana jako kwantyfikacja porównawcza. Alternatywnie można założyć, że wydajność amplifikacji celu i odniesienia jest nieistotna i określić ilościowo cel wyłącznie na podstawie krzywej standardowej określonej dla sekwencji referencyjnej. Wreszcie, w najdokładniejszej z technik kwantyfikacji względnej, mierzone są wydajności amplifikacji zarówno odniesienia, jak i celu, a następnie określany jest współczynnik korekcji. Proces ten, zwany normalizacją, 1 wymaga próbki zawierającej znane stężenia zarówno celu, jak i odniesienia oraz wygenerowania dwóch krzywych standardowych.
Określenie wydajności reakcji PCR
Wydajność PCR między próbką referencyjną a próbką docelową jest określana poprzez przygotowanie serii rozcieńczeń dla każdego celu. Wartości CT próbki referencyjnej są odejmowane od docelowej, a różnica w wartościach CT jest wykreślana względem logarytmu ilości matrycy. Jeśli uzyskane nachylenie linii prostej jest mniejsze niż ± 0,1, skuteczność amplifikacji uznaje się za podobną.
Equipment
- Urządzenie do ilościowego PCR
- Mikrowirówka
- Kaptur z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie)
Dostawy
- qPCR SYBR Green Mix - patrz Przewodniki wyboru qPCR (Część 1 i Część 2)
- Szablon DNA/cDNA - reakcja cDNA rozcieńczona 1:10 w celu wykrycia celów o średniej do wysokiej ekspresji lub 1:2 do 1:5 dla rzadkich transkryptów lub 10 ng do 100 ng gDNA
- Startery do przodu i do tyłu rozcieńczone do stężenia roboczego (zapasy robocze 10 µM są wystarczające dla większości testów)
- Zaprojektowane startery do ekspresji genów są również dostępne dla większości organizmów modelowych (KiCqStart® SYBR® Green Primers, KSPQ12012)
- Sterylny filtr końcówki do pipet
- Sterylne 1.5 ml zakręcane probówki do mikrowirówki (takie jak CLS430909)
- Probówki do PCR, wybierz probówki pasujące do żądanego formatu:
- Woda klasy PCR (W1754)
.Protokół
Przygotowanie
- Umieść wszystkie składniki reakcji na lodzie.
- Wymieszaj, a następnie krótko odwiruj, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
Standardowa reakcja z barwnikiem SYBR Green I
Uwaga: Zaobserwowaliśmy, że testy prowadzone w KiCqStart ReadyMix są optymalne przy użyciu wyższego stężenia starterów niż w konwencjonalnym PCR. W poniższych protokołach używamy końcowego stężenia 450 nM, które zaobserwowaliśmy jako optymalne stężenie dla kilku niezależnych testów.
1. Przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny wzorcowej do przeprowadzenia wszystkich próbek w duplikatach.
a. Pamiętaj, aby uwzględnić zduplikowane kontrole ujemne bez wzorca (NTC).
b. Wybierz odpowiednią tabelę poniżej w oparciu o wybrany odczynnik qPCR.
c. Oblicz ilość odczynników do wymieszania. Dodaj 10% objętości, aby uwzględnić błąd pipetowania
d. Dobrze wymieszać, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
Master Mix dla odczynników KiCqStart:
Master Mix dla innych kompletnych qPCR ReadyMix:
Master Mix dla odczynników qPCR z oddzielnymi składnikami:
1Optymalne stężenie MgCl2 może wynosić od 1mM do 6mM.
2Odnieś się do Appendix 1 aby określić optymalne stężenie barwnika referencyjnego dla danego urządzenia.
2. Konfiguracja reakcji:
a. W przypadku reakcji NTC dodaj 4 μL wody do probówki reakcyjnej.
b. W przypadku reakcji eksperymentalnych dodać 4 μL roztworu cDNA do probówki reakcyjnej.
c. Odwiruj krótko wszystkie probówki. Wizualnie potwierdzić, że wszystkie probówki lub studzienki zawierają próbkę na dnie w odpowiedniej objętości.
d. Ostrożnie odmierzyć 16 μL matrycowej mieszaniny wzorcowej do każdej probówki qPCR lub studzienki na płytce.
e. Dobrze wymieszać reakcje i w razie potrzeby odwirować.
f. Zamknąć probówki lub uszczelnić płytkę PCR i oznaczyć (zgodnie z wymaganiami urządzenia). (Upewnić się, że etykiety nie zasłaniają ścieżki światła wzbudzenia/detekcji urządzenia.)
3. Przeprowadź próbki zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia. Przykłady standardowego i szybkiego cyklu zostały zamieszczone poniżej.
Standardowe parametry cyklu:
Parametry szybkiej jazdy na rowerze:
Uwaga: Stosować standardowy protokół krzywej dysocjacji (zbieranie danych).
4. Wskazówki dotyczące analizy danych znajdują się w instrukcji obsługi urządzenia.
Apendix 1
Stężenia barwnika referencyjnego zalecane do stosowania z urządzeniami. Dla odczynników qPCR z oddzielnym barwnikiem referencyjnym
Przewodnik rozwiązywania problemów
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?