Jak działa qPCR

Real-time PCR, znany również jako ilościowy lub qPCR, określa rzeczywistą ilość produktu PCR obecnego w danym cyklu. Dzięki zastosowaniu raportu fluorescencyjnego w reakcji PCR, proces ten umożliwia pomiar wytwarzania DNA w teście qPCR. Istnieją dwie metody qPCR: SYBR Green i oparte na sondach.

SYBR Green-based qPCR

.

SYBR Green qPCR umożliwia monitorowanie amplifikacji dowolnej dwuniciowej sekwencji DNA. Nie wymaga sond, a tym samym zmniejsza koszty konfiguracji i eksploatacji testu. Ponadto wiele barwników może wiązać się z pojedynczą amplifikowaną cząsteczką, co zwiększa czułość wykrywania produktów amplifikacji.

SYBR Green qPCR Video Transcript

Real-time PCR, znany również jako ilościowy lub qPCR, określa rzeczywistą ilość produktu PCR obecnego w danym cyklu. Dzięki zastosowaniu fluorescencji w reakcji PCR, proces ten pozwala zmierzyć wytwarzanie DNA w qPCR assay. 

W reakcji SYBR Green qPCR masz szablon, który zawiera sekwencję docelową, którą jesteś zainteresowany. Potrzebne są również startery, dNTP i wybrana polimeraza DNA. Barwnik SYBR Green I jest zwykle zawarty w mieszaninie reakcyjnej zawierającej polimerazę DNA.

Denaturacja  jest pierwszym krokiem w reakcji PCR. Termocykler nagrzewa się do około 95 stopni Celsjusza, co powoduje, że dwuniciowa helisa DNA rozpuszcza się na dwie jednoniciowe matryce DNA.

Podczas etapu wyżarzania temperatura spada do 45-65 stopni Celsjusza, a jednoniciowe startery przyłączają się do odpowiednich końców sekwencji docelowej. Podczas tego cyklu polimeraza DNA przyłącza się do matrycy i rozpoczyna przyłączanie komplementarnych nukleotydów.

Na koniec, podczas rozszerzania, temperatura nieznacznie wzrasta do 65-75 stopni Celsjusza. Polimeraza DNA wydłuża starter specyficzny dla sekwencji z włączeniem nukleotydów, które są komplementarne do matrycy DNA.

SYBR Green I wiąże wszystkie nowo zsyntetyzowane dwuniciowe kompleksy DNA i fluoryzuje. Fluorescencja gromadzi się w miarę kontynuowania cyklu PCR i jest mierzona na końcu każdego cyklu PCR. Intensywność fluorescencji generowanej przez SYBR Green I powyżej poziomu tła (wartość Cq jest mierzona i wykorzystywana do ilościowego określenia ilości nowo wygenerowanego dwuniciowego DNA.

Po powtórzeniu cykli denaturacji, annealingu i wydłużania około 35-40 razy, można rozpocząć analizę. Wartości Cq można wykorzystać do ilościowego określenia początkowych ilości DNA, ustalenia krzywej standardowej do badań ekspresji genów lub innych analiz.

SYBR Green qPCR to doskonała opcja do monitorowania amplifikacji dowolnej dwuniciowej sekwencji DNA. Nie wymaga sond, a tym samym zmniejsza koszty konfiguracji i eksploatacji testu. Ponadto wiele barwników może wiązać się z pojedynczą amplifikowaną cząsteczką, co zwiększa czułość wykrywania produktów amplifikacji.

Kompatybilność urządzeń ma kluczowe znaczenie dla qPCR. Należy wybrać odpowiedni produkt dla danego urządzenia. Ponadto metody  qPCR różnią się poziomem wierności, szybkości i wygody. Zalecamy skorzystanie z przewodnika wyboru PCR i naszego zespołu wsparcia technicznego w celu wybrania odpowiednich produktów.

Probe-based qPCR

Sonda qPCR pozwala na specyficzną hybrydyzację. Ukierunkowany charakter qPCR opartego na sondach prowadzi do niskiego tła i eliminuje obecność wyników fałszywie dodatnich. Można również znakować sondy różnymi, rozróżnialnymi barwnikami reporterowymi, aby umożliwić amplifikację dwóch różnych sekwencji w jednej probówce reakcyjnej.

Probe-based qPCR Video Transcript

Real-time PCR, znany również jako ilościowy lub qPCR, określa rzeczywistą ilość produktu PCR obecnego w danym cyklu. Dzięki wykorzystaniu fluorescencji w reakcji PCR, proces ten pozwala zmierzyć wytwarzanie DNA w teście qPCR. 

W reakcji qPCR opartej na sondzie masz szablon, który zawiera sekwencję docelową, którą jesteś zainteresowany. Potrzebne są również startery, dNTP i wybrana polimeraza DNA. Ponadto potrzebna będzie sonda oznakowana zarówno cząsteczką reporterową, jak i cząsteczką wygaszającą. Zazwyczaj sondy są sprzedawane jako oddzielne, niestandardowe produkty, ponieważ są specyficzne dla sekwencji docelowej.

Denaturacja jest pierwszym etapem reakcji PCR. Termocykler nagrzewa się do około 95 stopni Celsjusza, co powoduje, że dwuniciowa helisa DNA roztapia się na dwie jednoniciowe matryce DNA.

Podczas etapu analinyg temperatura spada do 45-65 stopni Celsjusza, a jednoniciowe startery przyłączają się do odpowiednich końców sekwencji docelowej. Podczas tego cyklu polimeraza DNA przyłącza się do starterów i rozpoczyna przyłączanie komplementarnych nukleotydów.

Na koniec, podczas rozszerzania, temperatura nieznacznie wzrasta do 65-75 stopni Celsjusza.Podczas tej fazy polimeraza DNA wydłuża starter specyficzny dla sekwencji z włączeniem nukleotydów komplementarnych do matrycy DNA.Następnie polimeraza DNA wypiera cząsteczkę reporterową z sondy, co powoduje fluorescencję.

Fluorescencja gromadzi się w miarę kontynuowania cyklu PCR i jest mierzona na końcu każdego cyklu PCR. Intensywność fluorescencji generowanej przez cząsteczkę reporterową powyżej poziomu tła (wartość Cq) jest mierzona i wykorzystywana do ilościowego określenia ilości nowo wygenerowanych dwuniciowych nici DNA.

Po powtórzeniu cykli denaturacji, annealingu i wydłużania około 35-40 razy można rozpocząć analizę. Wartości Cq można wykorzystać do ilościowego określenia początkowych ilości DNA, ustalenia krzywej standardowej do badań ekspresji genów lub innych analiz.

Preparat qPCR oparty na sondach jest doskonałym rozwiązaniem dla specyficznej hybrydyzacji, braku fałszywie dodatnich wyników i amplifikacji dwóch różnych sekwencji w jednej probówce reakcyjnej.

Dowiedz się więcej o naszej kompletnej ofercie qPCR i jak wybrać odpowiednie odczynniki do swojego eksperymentu.