Protokół hodowli ludzkich fibroblastów płuc (HLF)

I. Przechowywanie

A. Fiolki kriokonserwowane (506-05a, 506-05f)

Przechowywać fiolki kriokonserwowane w zbiorniku z ciekłym azotem natychmiast po ich dostarczeniu.

*Podczas wyjmowania fiolek kriokonserwowanych ze zbiornika z ciekłym azotem należy nosić maskę ochronną i rękawice. Gwałtowna zmiana temperatury między zbiornikiem a pomieszczeniem może spowodować pęknięcie uwięzionego w fiolkach ciekłego azotu i obrażenia.

Ludzkie fibroblasty płuc (HLF)

II. Przygotowanie do hodowli

1. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego klasy II z laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA jest w odpowiednim stanie technicznym.
2. Sterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% alkoholem.
3. Włącz dmuchawę szafki bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed rozpoczęciem pracy z hodowlą komórkową.
4. Upewnij się, że wszystkie pipety serologiczne, końcówki do pipet i roztwory odczynników są sterylne.
5. Przestrzegaj standardowej techniki sterylizacji i zasad bezpieczeństwa:
   a. Nie pipetować doustnie.
   b. Zawsze nosić rękawice i okulary ochronne podczas pracy z ludzkimi komórkami, nawet jeśli wszystkie szczepy zostały przebadane na obecność wirusa HIV, zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu C.
   c. Wszystkie prace związane z hodowlą komórek należy wykonywać w sterylnym pomieszczeniu.

III. Hodowla HLF

A. Przygotowanie kolb do hodowli HLF

1. Wyjmij z lodówki pożywkę do hodowli fibroblastów (116-500). Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Nanieść pipetą 15 ml pożywki do hodowli fibroblastów (116-500)* do kolby T-75 (SIAL0641).
   * Stosunek pożywki do powierzchni powinien wynosić 1 ml na 5 cm². -  5 ml dla kolby T-25 (SIAL0639) lub szalki do hodowli tkanek o średnicy 60 mm (SIAL0166).<15 ml dla kolby T-75 (SIAL0641) lub naczynia do hodowli tkanek o średnicy 100 mm (SIAL0167).

B. Rozmrażanie i umieszczanie HLF

1. Wyjmij kriokonserwowaną fiolkę HLF ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu, stosując odpowiednią ochronę oczu i rąk.
2. Obróć korek fiolki o ćwierć obrotu, aby uwolnić ciekły azot, który może być uwięziony w gwintach, a następnie ponownie dokręć korek.
3. Szybko rozmroź komórki, umieszczając dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i uważnie obserwuj fiolkę podczas procesu rozmrażania.
4. Wyjmij fiolkę z łaźni wodnej, gdy w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu.Nie dopuścić do całkowitego rozmrożenia komórek.
5. Odkazić zewnętrzną powierzchnię fiolki 70% alkoholem w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Ostrożnie zdjąć korek fiolki. Nie dotykaj brzegu nakrętki ani fiolki rękami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Zawieś ponownie komórki w fiolce, delikatnie pipetując komórki 5 razy pipetą o pojemności 2 ml. Uważaj, aby nie pipetować zbyt energicznie, aby nie spowodować spienienia.
8. Zmieszaj pipetą zawiesinę komórek (1 ml) z fiolki do kolby T-75 (SIAL0641) zawierającej 15 ml pożywki do wzrostu fibroblastów (116-500).
9. Zamknąć kolbę i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
10. Umieścić kolbę T-75 (SIAL0641) w inkubatorze z nawilżaniem 37°C, 5% CO₂. Poluzuj korek, aby umożliwić wymianę gazową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie należy zakłócać hodowli przez 24 godziny po inokulacji.
11. Zmień na świeżą pożywkę do wzrostu fibroblastów (116-500) po 24 godzinach lub przez noc, aby usunąć wszystkie ślady DMSO.
13. Zmieniaj Fibroblast Growth Medium (116-500) co drugi dzień, aż komórki osiągną 60% konfluencji.
14. Podwoić objętość pożywki Fibroblast Growth Medium (116-500), gdy hodowla osiągnie 60% konfluencji lub w przypadku karmienia weekendowego.
15. Podkulturuj komórki, gdy hodowla HLF osiągnie 80% konfluencji.

IV. Podhodowla HLF

A. Przygotowanie odczynników do podhodowli

1. Wyjmij Roztwór trypsyny-EDTA (T3924) i Inhibitor trypsyny (T6414) z zamrażarki o temperaturze -20 °C i rozmroź przez noc w lodówce.
2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki do podhodowli są rozmrożone. Delikatnie zawiruj każdą butelkę kilka razy, aby utworzyć jednorodne roztwory.
3. Przechowuj wszystkie odczynniki do podhodowli w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
4. Odmierz roztwór trypsyny/EDTA (T3924) i przechowuj niewykorzystaną część w temperaturze -20 °C, jeśli potrzebna jest tylko część roztworu trypsyny/EDTA (T3924).

B. Przygotowanie kolby hodowlanej

1. Wyjmij Pożywkę do wzrostu fibroblastów (116-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Odmierzyć pipetą 30 ml pożywki do hodowli fibroblastów (116-500) do kolby T-175 (SIAL1080) (do użycia w sekcji IV C, krok 15.)

C. Subkulturowanie HLF

Trypsynować komórki w temperaturze pokojowej. Nie podgrzewaj żadnych odczynników do temperatury 37°C.

1. Usuń pożywkę z kolb hodowlanych przez aspirację.
2. Umyj monowarstwę komórek za pomocą HBSS (H6648) i usuń roztwór przez aspirację.
3. Pobierz pipetą 6 ml roztworu trypsyny/EDTA (T3924) do kolby T-75 (SIAL0641). Delikatnie potrząśnij kolbą, aby upewnić się, że roztwór pokrywa wszystkie komórki.
4. Natychmiast usuń 5 ml roztworu.
5. Zamknij szczelnie kolbę i monitoruj postęp trypsynizacji w temperaturze pokojowej pod odwróconym mikroskopem. Zazwyczaj potrzeba około 2 do 4 minut, aby komórki stały się zaokrąglone.
6. Uwolnij zaokrąglone komórki z powierzchni hodowli, uderzając bokiem kolby o dłoń, aż większość komórek zostanie odłączona.
7. Nanieś pipetą 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) do kolby, aby zahamować dalszą aktywność tryptyczną.
8. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
9. Przepłucz kolbę dodatkowymi 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) i przenieś roztwór do tej samej probówki stożkowej.
10. Zbadaj kolbę T-75 (SIAL0641) pod mikroskopem. Jeśli w kolbie pozostało 20% komórek, powtórz kroki 2-9.
11. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 220 x g przez 5 minut, aby osuszyć komórki.
12. Spuść supernatant z probówki bez naruszania osadu komórek.
13. Przesuń końcówkę stożkowej probówki palcem, aby poluzować osad komórek.
14. Zawieś ponownie komórki w 5 ml pożywki do wzrostu fibroblastów  (116-500), delikatnie pipetując komórki w celu rozbicia grudek.
15. Zlicz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zaszczepić 10 000 komórek na cm² dla szybkiego wzrostu lub 7 500 komórek na cm² dla regularnych subkultur.

.